Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna “B. Ubertini”,
1Sezione Diagnostica di Pavia - Centro di Referenza Nazionale per la Tularemia, 2Laboratorio di Analisi Genomiche, Brescia
Parole chiave: Francisella tularensis, genotipizzazione, MLVA
SUMMARY
MLVA analyses was applied to Italian collection of F. tularensis subspecies holarctica strains in order to investigate the genetic diversity of the isolates. Among seven VNTR loci examined, Ft-M3, Ft-M6 and Ft-M24 were the most informative. We obtained twelve different clusters by MLVA analyses, while sequence analyses of the 3 loci (FtM-3, Ft- M6 and Ft-M24) grouped the isolates in four clusters related to the source of infection. Interestingly, isolates from native hares grouped separately to those of imported hares. Our data increase the epidemiological information about the genetic diversity between the european and italian strains of F. tularensis subsp. holarctica
INTRODUZIONE
Francisella tularensis è un batterio gram negativo intracellulare facoltativo agente eziologico della tularemia, una malattia zoonosica diffusa in tutto l’emisfero nord del mondo. Colpisce prevalentemente roditori e lagomorfi nei quali si manifesta solitamente con quadri di setticemia acuta rapidamente fatale. F.tularensis è in grado di infettare più di 100 specie tra cui mammiferi, anfibi, pesci e artropodi (7). L’infezione può avvenire per contatto diretto con animali infetti o i loro fluidi, attraverso il consumo di acqua o cibi contaminati, l’inalazione di aerosol infetto o tramite la puntura di artropodi in particolare zecche e zanzare. F. tularensis è uno dei batteri a più elevata capacità infettante conosciuti e per le sue caratteristiche è inserito nella lista A dei 6 agenti biologici più pericolosi utilizzabili a fini bioterroristici redatta dal Center for Disease Control and Prevention (3). Gli altri agenti inclusi sono Y. pestis, C. botulinum, Variola major, B. anthracis e i Virus delle Febbri Emorragiche (Ebola, Marburg, Lassa, ecc).
Ad oggi sono note 4 subspecie di F. tularensis: F. tularensis subsp. tularensis (tipo A), F. tularensis subsp holarctica (tipo B), F. tularensis subsp. mediasiatica e F. tularensis subsp. novicida (8).
F. tularensis subsp. tularensis e F. tularensis subsp. holarctica sono quelle più patogene e quindi più importanti dal punto di vista zoonosico. La prima, altamente patogena, è confinata in Nord America anche se una segnalazione ne riporta l’isolamento anche in Europa pur senza altro seguito. La seconda, più moderatamente patogena, è presente in Europa, Asia e Nord America. Francisella tularensis è abbastanza resistente nell’ambiente (acqua e terreno) e nelle carcasse in decomposizione (alcune settimane). In particolare l’ambiente acquatico è considerato un importante ecosistema in grado di mantenere a lungo il batterio vitale attraverso i rapporti simbiontici con le amebe a vita libera al pari dei batteri del genere Legionella.
L’aumento delle conoscenze legate alla biologia molecolare ha portato all’acquisizione di preziose informazioni di ordine epidemiologico anche attraverso l’esame dei ceppi di Francisella tularensis. Queste nuove tecniche, attraverso lo studio di tratti del DNA batterico, consentono spesso anche
di stabilire l’associazione geografica del ceppo batterico esaminato e quindi dell’animale o della epidemia che ha generato. Questo è un aspetto sanitario non secondario dato che l’Italia è un forte importatore di lepri da diversi Paesi dall’Est Europa, un’area notoriamente endemica per la tularemia.
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di applicare la metodica Multi-Locus VNTR Analysis (MLVA) come sistema di genotipizzazione che consentisse verificare la diversità genetica tra i ceppi circolanti in Italia e di creare un database Italiano.
MATERIALI E METODI
I ceppi di F. tularensis oggetto dello studio sono stati raccolti dal Centro di Referenza Nazionale per la Tularemia tra il 1964 e il 2011 Complessivamente sono stati esaminati 28 ceppi isolati da lepre, acqua e uomo. Due di questi provenivano dall’ex URSS frutto della storica collaborazione con il prof N. Olsufjev del Gamaleya Institute of Epidemiology and Microbiology di Mosca. E’ stato altresì aggiunto ai ceppi sottoposti al test anche un ceppo di riferimento di Francisella tularensis subsp. tularensis (tipo A) avirulento (ATCC6223). Dato che alcuni dei nostri isolati risalivano anche a più di 40 anni fa, tutti i ceppi sono stati rivitalizzati in Cystine Heart Agar e da ciascun isolato è stato estratto il DNA utilizzando il kit commerciale DNeasy® Blood and Tissue kit (Qiagen, Milano). Il DNA è stato quindi esaminato per confermare l’identificazione di specie sia mediante PCR convenzionale e sia mediante Real- Time-PCR amplificando tre diversi target: i geni codificanti per una lipoproteina di 17kDa (6), per l’elicasi (2) e la regione gnomica RD1 (1). Applicando quindi la metodica Multi Locus VNTR Analysis (MLVA) sono stati analizzati sette loci: Ft-M3, Ft-M4, Ft-M6, Ft-M10, M13, Ft-M20 e Ft-M24 (4). Ciascun locus è stato amplificato e sequenziato per poter valutare sia le dimensioni che il numero di ripetizioni (repeats). L’indice di discriminazione è stato calcolato mediante la formula di Hunter e Gaston (10). Inoltre, per verificare la stabilità dei loci, ed escludere eventuali variazioni dovute ai processi di isolamento e conservazione, tre differenti ceppi sono stati trapiantati ripetutamente per 10 volte e successivamente sottoposti all’analisi MLVA ad ogni passaggio. Infine è stata eseguita un’analisi filogenetica sulle sequenze dei loci Ft-M3, Ft-M6 e Ft-M24 mediante il software MEGA 5.0 (9)
RISULTATI
Tutti i ceppi analizzati in questo studio sono stati identificati mediate amplificazione specie-specifica di tre differenti target (tul4, elicasi e RD1) come appartenenti alla specie F. tularensis subsp. holarctica (tipo B), ad eccezione del ceppo ATCC 6223 utilizzato come riferimento (ceppo avirulento classificato come F. tularensis subsp. tularensis - tipo A). L’analisi MLVA ha consentito di raggruppare i 28 ceppi in 12 differenti clusters. L’indice discriminatorio calcolato secondo la formula di Hunter e Gaston è di 0,85 (0,743-0,957 IC 95%). Il gruppo principale (12 isolati) proveniva da lepri autoctone,
mentre un altro grosso gruppo composto da cinque isolati proveniva da lepri importate dall’est Europa. I due ceppi isolati dall’acqua di fonte presentavano un unico profilo MLVA, mentre il resto dei ceppi si suddivideva in ulteriori 9 differenti cluster. Infine il ceppo di F. tularensis subsp. tularensis (ATCC 6223) mostrava, come atteso, un profilo nettamente diverso dagli altri.
L’analisi filogenetica condotta con il metodo statistico UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Aritmetic Mean) con bootstrap (n°repliche 1000) su i loci Ft-M3, Ft-M6 e Ft-M24 ha confermato la presenza di 4 principali genotipi differenti. Nel genotipo 1 sono raggruppati tutti i ceppi isolati da lepri autoctone, nel genotipo 2 i ceppi isolati da una fonte d’acqua e legati ad una importante epidemia verificatasi in Toscana nel 2008, nel genotipo 3 i ceppi isolati da lepri importate da paesi dell’ Europa dell’est ed infine il genotipo 4 che comprendeva il solo ceppo di F. tularensis subsp. tularensis (ATCC 6223) (Fig.1).
Fig.1: Albero filogenetico dei ceppi di Francisella tularensis isolati in Italia.
Infine, riguardo la possibilità di una variazione e/o alterazione del numero di ripetizioni abbiamo osservato stabilità all’interno dei singoli locus sia come lunghezza del frammento, sia come numero di ripetizioni.
DICUSSIONE E CONCLUSIONI
La metodica MLVA si è rivelata uno strumento molecolare altamente discriminatorio utile ad effettuare studi di tipo epidemiologico. Abbiamo, infatti, rilevato la presenza di una diversità genetica tra i ceppi di F. tularensis circolanti in Italia. In particolare, i ceppi isolati dalle lepri autoctone e quelli isolati dalle lepri importate dall’est Europa presentavano genotipi diversi tra di loro, suggerendo la presenza di ceppi di diversa origine. I ceppi isolati dalla fonte d’acqua toscana sono risultati filogeneticamente più vicini a quelli isolati dalle lepri autoctone, che definiremmo “nazionali”, rispetto a quelli isolati dalle lepri importate, indicando una probabile origine comune dei due gruppi. I risultati ottenuti con la metodica MLVA sono stati rafforzati attraverso l’analisi filogenetica dei loci Ft-M3, FtM6 e Ft-M24, che si sono dimostrati quelli
maggiormente disciminatori tra i 7 scelti per la tipizzazione degli isolati di F. tularensis. L’elevato numero di clusters ottenuti malgrado i soli 28 ceppi analizzati sottolinea l’elevato potere discriminatorio dell’analisi MLV applicata in questo studio. Inoltre, la conferma della stabilità dei loci analizzati rende questo tipo di analisi affidabile e riproducibile.
Questo lavoro ha permesso la creazione del primo database italiano relativo ai ceppi di Francisella tularensis uno dei patogeni zoonosici noti a più elevata capacità infettante. Tale database, unito ad altre informazioni epidemiologiche (es provenienza dei ceppi e/o possibili collegamenti fra le diverse fonti d’infezione), consentirà di inquadrare con maggior precisione la fonte di contaminazione oltre alla possibilità di una collocazione geografica più precisa dei ceppi sia in presenza di casi di malattia degli animali che dell’uomo.
BIBLIOGRAFIA
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