1Piredda I., 1Palmas B., 1Noworol M., 1Canu M., 1Fiori E., 2Picardeau M., 1Tola A., 1Pintore A., 1Ponti N.
1Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna, Dipartimento Sanità Animale,
Laboratorio Sieroimmunologia e Gestione Tecnica Piano eradicazione ruminanti, Sassari
2Institut Pasteur, Unitè de Biologie des Spirochetès, Paris
Key Words: Leptospirosi, diagnostica, suini
ABSTRACT
The aim of this study was to value the prevalence of Leptospira pathogenic in samples of wild boar (Sus scrofa) collected during the 2009-2011 hunting season in Sardinia. A total of 767 samples (419 kidneys, 73 urine and 233 serum) were analysed (Tab.1). L. interrogans serovar Pomona was isolated in 34 samples of 492 (7%), while 244 samples of 419 (58%) were PCR positive for the presence of species-specific genes of rRNA 16S. 233 serum samples were tested for specific antibodies by Microscopic agglutination test (MAT) and 67 were titrated. The serovar Grippotyphosa and Pomona were the most representative. The isolates were tested by Institute Pasteur (Paris) by partial rrs gene sequencing, VNTR and PFGE.
INTRODUZIONE
La leptospirosi è una zoonosi causata da una spirocheta patogena del genere Leptospira. È una malattia infettiva che colpisce moltissime specie di mammiferi domestici e selvatici, con differenti manifestazioni a seconda del ceppo e della specie coinvolti (1). L’agente eziologico, dotato di scarsissima resistenza nell’ambiente esterno, mantiene il suo ciclo vitale grazie a ospiti serbatoio specifici per ogni sierovariante, nei quali l’infezione esita spesso nello stato di portatore, caratterizzato da assenza di sintomi e presenza persistente della spirocheta in alcuni organi/apparati. In Italia la sieropositività alla leptospira nei cinghiali (Sus scrofa) è stata documentata già quindici anni fa (2,3). In Sardegna, la specie nella quale la leptospirosi esplica principalmente la sua azione patogena è quella suina. I danni e le perdite economiche per gli allevatori sardi sono ingenti soprattutto perché solitamente non viene praticata la vaccinazione. Lo studio da noi intrapreso ha avuto come fine ultimo valutare il potenziale ruolo di questi animali selvatici come serbatoi di leptospire nel centro-nord Sardegna, attraverso l’evidenziazione di anticorpi su siero mediante il Test di Microagglutinazione (MAT), del DNA nei reni mediante Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) e dei microrganismi mediante esame colturale.
MATERIALI E METODI
Gli studi sono stati condotti in una regione ubicata nel centro della Sardegna settentrionale chiamata Goceano il cui territorio si estende per 481 km. L’indagine è stata effettuata su campioni d’organo urine e siero, raccolti da animali abbattuti nella zona di studio durante il periodo venatorio 2009/2010 e 2010/2011 (Fig. 1). I cinghiali sono stati classificati per età (in base all’esame della dentatura), sesso e luogo di morte. Nel primo anno sono stati raccolti 191 campioni di rene, 52 di urine e 43 di siero. L’anno successivo sono stati raccolti 228 reni, 21 urine e 190 sieri (Tab.1). La determinazione anticorpale su siero è stata condotta mediante MAT, utilizzando un pannello di 9 leptospire come antigene (Tab.2). Gli antigeni sono stati
coltivati in terreno di base Ellinghausen-MacCullough-Johnson- Harris (EMJH-Difco, Detroit, Michigan, USA) ed il test è stato eseguito mediante procedura riportata da Faine et al. (4). Tab. 1 Campioni esaminati nelle due stagioni venatorie
MATRICE 2009/2010 2010/2011
RENI 191 228
URINE 52 21
SIERI 43 190
TOT. CAMPIONI 286 439
Tab. 2 Elenco ceppi usati come antigene nella MAT
Genospecie Sierogruppo Serovar Ceppo
L. interrogans Sejroe Hardjo Hardjoprajitno n°224
L. kirschneri Grippotyphosa Grippotyphosa Moska V n°54
L. interrogans Australis Bratislava Riccio 2 n°47
L. interrogans Pomona Pomona Pomona n°222
L. borgpetersenii Tarassovi Tarassovi Mitis Johnson n°6
L. interrogans Icterohaem. Icterohaem. RGA 20
L. interrogans Icterohaem. Copenhageni Wijnberg n°1
L. interrogans Canicola Canicola Alarik n°2
L. borgpetersenii Ballum Ballum Mus 127 n°217
Per le urine e gli organi (precedentemente omogenati) invece, è stata eseguita la semina in tre tubi contenenti terreno EMJH semisolido (0,1% agar). L’incubazione delle colture avviene in condizioni di aerobiosi a 28-30°C in termostato al buio. Gli stessi substrati sono stati utilizzati per la diagnosi molecolare diretta mediante PCR, in cui una coppia di primers (Lepat1 e Lepat2) amplificano una parziale sequenza del gene 16S rRNA di leptospira lunga 324 bp rilevabile mediante elettroforesi in gel d’agar al 2% (5). Le leptospire isolate mediante coltura invece, sono state tipizzate mediante indagini VNTR (Variable Number Tandem Repeats) e l’ausilio della PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis). Dopo l’iniziale estrazione del DNA dal microrganismo utilizzando un apposito kit (Qiagen), si applica il protocollo di amplificazione mediante cinque set di primers: VNTR-4, VNTR-7, VNTR-10, VNTR-Lb4 e VNTR-Lb5 (6). I primi tre vengono applicati alle genospecie interrogans, kirschneri, noguchi e borgpetersenii, mentre gli ultimi due sono specifici per la sola genospecie L. borgpetersenii. Ciascuna coppia di primers individua un set di bande specifico per quel serovar. Infine, la macrorestrizione genomica con taglio da parte di endonucleasi di restrizione seguita da una elettroforesi in campo pulsato (PFGE), permette la clusterizzazione del microrganismo.
RISULTATI
Dai 492 campioni sottoposti ad esame colturale sono stati isolati complessivamente 34 ceppi (prevalentemente da
rene) i quali, a seguito di tipizzazione biomolecolare ad opera dell’Unitè de Biologie des Spirochetès Istitut Pasteur di Parigi, sono risultati essere tutti genospecie L. interrogans serovar Pomona. Dei 233 campioni di siero pervenuti, 67 sono risultati positivi alla MAT (29%) e quindi sottoposti a titolazione con i ceppi elencati in Tab. 4. Le sierovarianti Grippotyphosa e Pomona si sono rivelate le più diffuse rispettivamente con il 62 e 60%, in accordo con i risultati ottenuti dalla tipizzazione molecolare. A seguire Bratislava con il 40% e Hardjo con il 30% (Fig. 2). Infine, dei 492 campioni totali, 426 sono stati testati mediante PCR, rivelando una positività del 57% (Tab. 3). Dei 421 capi abbattuti 213 erano femmine e 203 maschi, di cui perlopiù di età > 30 mesi.
Tab. 3 Elenco attività diagnostiche
Coltura
Camp.
Esam. Camp. Pos. Camp. Esam. Camp. Pos. Camp. Esam. Camp. Pos.
Reni 419 33 419 242 - -
Urine 73 1 7 2 - -
Siero - - - - 233 67
TOT. 492 34 426 244 233 67
Tab. 4 Titolazioni sierologiche (Ha=hardjo; Gr= grippotyphosa; Br=Bratislava; Po=pomona; Ta=tarassovi;
Ic=icterohaemorragiae; Cop=copenhageni) Ha Gr Br Po Ta Ic Cop 1:100 12 15 10 12 4 6 1 1:200 5 15 11 11 4 4 1 1:400 2 7 2 8 2 1 1:800 1 1 3 4 4 1 1:1600 2 5 3 1:3200 1 2
Totale
20
40
27
42
17
11
3
DISCUSSIONEGli esami batteriologici e molecolari effettuati a partire da organi ed urine delle ultime annate venatorie, pongono l’accento sulla suscettibilità e sul probabile ruolo di questi animali selvatici nel mantenimento e nella trasmissione dell’infezione alle specie domestiche allevate allo stato semi-brado con cui condividono lo stesso habitat. Effettivamente la leptospirosi resta una patologia sottostimata in quanto prevalgono le forme silenti o le forme cliniche con sintomatologia simil-influenzale che vengono spesso risolte con la terapia antibiotica. L’applicazione di alcune misure di tipo profilattico, come l’utilizzo di vaccini sia per le categorie professionali più esposte che per gli animali maggiormente a rischio, come anche l’abolizione della promiscuità tra specie animali diverse e tra domestici e selvatici, ridurrebbe sicuramente la prevalenza delle spirochete nel nostro territorio. I cinghiali inoltre potrebbero giocare un ruolo chiave nell’epidemiologia della L. interrogans, perché la densità di queste specie selvatiche nelle nostre aree è molto elevata (7-10 capi/100ha); non devono quindi essere trascurati gli aspetti legati alla sanità pubblica oltre ai danni che questa specie arreca alle attività e alle produzioni agricole, alle fitocenosi forestali, alle specie ornitiche che nidificano a terra e gli incidenti stradali provocati.
BIBLIOGRAFIA
1) Levett PN. Leptospirosis. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14: 296-326.
2) Farina R., and Andreani E. Leptospirosi degli animali selvatici in Italia. Archivio Veterinario Italiano. 1970; 21: 127-141.
3) Tagliabue S., and Farina R. Inchiesta sieroepidemiologica sulla diffusione delle leptospire tra gli animali domestici ed alcune specie selvatiche. Selezione Veterinaria 1995; 36: 941-952.
4) Faine S., Adler B., Bolin C., and Perolat P. Leptospira and leptospirosis, 2nd Edition MediSci, Melbourne, Australia. 1999; 180.
5) Murgia R., Riquelme N., Baranton G. and Cinco M. Oligonucleotides specific for pathogenic and saprophytic leptospira occurring in water. FEMS Microbiol. Lett. 1997; 148: 27-34.
6) Salaün L., Merien F., Gurianova S., Baraton G., and Picardeau M. Application of Multilocus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis for Molecular Typing of the Agent of Leptospirosis. J. of Clin. Microbiol. 2006; 3954-3962.
Fig. 1 Areali del Goceano interessati allo studio.