Borriello G.1, Pesciaroli M.2, Lucibelli M. G.1, Cerrone A.1, Riccone N.1, Paradiso R.1, Ammendola S.3, Graziani C.2, Battistoni A.3, Pasquali P.2, Galiero G.1
1Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Dipartimento di Sanità Animale, Portici (NA); 2Istituto Superiore di Sanità,
Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare, 3Roma; Dipartimento di Biologia, Università di Tor Vergata, Roma
Key words: Salmonella, water buffalo
SUMMARY
Fourteen isolates of S. Typhimurium isolated from diarrhoeic water buffalo calves were genotyped by PCR detection of virulence genes. The isolates exhibited 10 different genetic profiles. The pathogenicity of the most representative 3 strains was tested in vivo. The most pathogenic strain could be differentiated by the others for the presence of the locus agfA coding for a fimbrial adhesion factor. These results suggest a possible key role of this fimbria in the pathogenesis of salmonellosis and might contribute to a better understanding of the role of this pathogen in the aetiology of diarrhoea in water buffalo calves.
INTRODUZIONE
Le malattie indotte nel vitello bufalino dai microrganismi appartenenti al genere Salmonella si caratterizzano per l’elevata morbi-mortalità e per la sintomatologia che, sebbene talvolta sia di tipo sistemico per il coinvolgimento di articolazioni, polmoni e tessuto cerebrale, sempre si contraddistingue per la seria compromissione del tratto gastroenterico con diarrea e conseguente grave disidratazione (5). In Italia sono riportati isolamenti di varie serovars, ma nessun sierotipo di Salmonella sembra essere ospite-adattato al bufalo. Durante la nostra quotidiana attività diagnostica, tuttavia, si isolano con maggiore frequenza S. Typhimurium e S. Muenster, e si osserva che ad essere colpiti sono soprattutto i soggetti di 1-12 settimane di età. Definire la patogenicità per la specie bufalina di questo sierotipo non è compito semplice, poiché l’importanza dei quadri clinici e delle lesioni anatomo-patologiche riscontrati in corso di salmonellosi da S. Typhimurium possono alquanto variare in termini di gravità, e questo può dipendere dall’interazione ospite-patogeno, la quale è senz’altro influenzata dalla via di ingresso, dalla dose infettante, dalla naturale o acquisita resistenza dell’ospite e dalla eventuale compartecipazione di altri agenti eziologici (5). Nondimeno, un ruolo fondamentale nel determinare la gravità della malattia, potrebbe essere legato alla differente virulenza del sierotipo coinvolto. Il presente lavoro intende effettuare una caratterizzazione genotipica di vari ceppi di S. Typhimurium isolati in corso di patologia enterica in vitelli bufalini e, per alcuni di essi, anche una valutazione fenotipica. Allo scopo sono stati ricercati specifici geni che codificano per diversi fattori di patogenicità ed inoltre sono state condotte prove di competizione nel topo tra alcuni dei virulotipi in esame.
MATERIALI E METODI
Ceppi batterici e metodi diagnostici
Lo studio è stato condotto nella regione Campania, durante gli anni 2006 – 2007, su 191 vitelli bufalini, di età compresa tra 1 e 12 settimane, affetti da sindrome gastroenterica. Le feci di tali animali sono state raccolte e testate per la presenza di Salmonella spp. mediante metodo microbiologico (10).
Le salmonelle isolate sono state sierotipizzate secondo lo schema di Kaufmann-White l’identificazione e’ stata confermata dal Centro di Refenza Nazionale per le Salmonellosi (IZSVe).
Estrazione del DNA e metodi molecolari
Il DNA batterico è stato estratto da 1 ml di coltura utilizzando la
resina Chelex 100 (BioRad) e analizzato per la presenza dei geni elencati in Tabella 1 mediante PCR.
Tab. 1 - Geni di Salmonella ricercati mediante PCR
Prodotto genico Gene a Primers 5’ – 3’ bp fattore di virulenza gipA (7) GCAAGCTGTACATGGCAAAG GGTATCGGTGACGAACAAAT 212 fattore di virulenza gogB (4) GCTCATCATGTTACCTCTAT AGGTTGGTATTTCCCATGCA 598 fattore di virulenza sopE (4) CGAGTAAAGACCCCGCATAC GAGTCGGCATAGCACACTCA 363 fattore di virulenza gtgB (7) TGCACGGGGAAAACTACTTC TGATGGGCTGAAACATCAAA 436 fattore di virulenza sspH1 TGCAGAAAAAGGGGAATACG GCAGCCTGAAGGTCTGAAAC 246 fattore di virulenza sspH2 GCACAACTGGCTGAAGATGA TTTCCCAGACGGAACATCTC 203 fattore di virulenza gtgE (1) AGGAGGAGTGTAAAGGT GTAGAACTGGTTTATGAC 1114 fattore di virulenza sodC1 (1) TATTGTCGCTGGTAGCTG CAGGTTTATCGGAGTAAT 468 plasmide di virulenza spvC (2) ACTCCTTGCACAACCAAATGCGGA TGTCTTCTGCATTTCGCCACCATCA 571
cromosoma invA (2) ACAGTGCTCGTTTACGACCTGAAT
AGACGACTGGTACTGATCGATAAT 244
fimbria stfE ATTTGGCAATGTGTTGACGATTTGCAGACGGATACCCAAT 185
fimbria safC CTCGCTGTCATTGAACTGGACACCGTGTGATGGTGAAGTC 158
fimbria csgA GGATTCCACGTTGAGCATTTCGGAGTTTTTAGCGTTCCAC 212
fimbria ipfD TTCCCTCAATACGCAGGAAGCTCAGGGCTGTGAACTCTCC 183
fimbria bcfC CAGCTTTTCATGACGCGATACAATGTCTCTGGTTGCGAGA 241
fimbria stbD GGCTGTAATATTCGCCGGTAGCACGCCCTATTCCAGTAAA 201
fimbria pefA (9)ACACGCTGCCAATGAAGTGAACTGCGAAAGATGCCACAGA 450
fimbria fimA CCTTTCTCCATCGTCCTGAATGGTGTTATCTGCCTGACCA 85
fimbria agfA (9)GGATTCCACGTTGAGCATTTGTTGTTGCCAAAACCAACCT 312
a Dove non è riportata la referenza, i primer e i protocolli di PCR
sono stati messi a punto dagli autori
I protocolli di PCR sono stati condotti come descritto in letteratura (1, 2, 4, 6, 7, 9). Dove non è riportata la referenza, i primer sono stati disegnati dagli autori utilizzando il software Primer3 e le reazioni di PCR sono state effettuate in un volume finale di reazione di 25 ml contenente HotStar Taq Master Mix (QIAGEN) 1 X, 0.4 mM di ogni
primer e 1 ml di DNA. I profili termici includevano una fase iniziale di denaturazione a 95ºC per 15 minuti, seguiti da 35 cicli a 95ºC per 30 secondi, Tx per 30 secondi e 72ºC per 1 min, e una fase finale di estensione a 72ºC per 5 min. La temperatura di annealing Tx era 50ºC per I geni sodC1 e gtgE, e 58 ºC per gli altri geni. I prodotti di amplificazione sono stati risolti mediante elettroforesi su gel di agarosio al 3% e visualizzati ai raggi UV dopo colorazione con SYBRsafe (Invitrogen).
Prove di competizione in vivo nel topo
Tre differenti ceppi di S. Typhimurium (S. Typhimurium # 16, S. Typhimurium # 92, S. Typhimurium # 112) sono stati utilizzati per condurre delle infezioni miste nel topo secondo il metodo descritto da Beuzon e Holden (3). Brevemente, 200 μl di sospensioni batteriche contenenti alternativamente due dei tre ceppi in esame nella proporzione di 1:1, sono state inoculate per via intraperitoneale (2×104/topo) o per via orale (2×107/topo) in femmine di topi BALB/c di 8-10 settimane di età. A 4 (ip) e 7 (os) giorni dall’infezione, la milza, asetticamente rimossa, e’ stata omogenata in soluzione salina. L’entità’ della colonizzazione splenica dei 2 ceppi posti in competizione e’ stata valutata sfruttando le naturali resistenze antibiotiche precedentemente determinate per ciascun ceppo. Diluizioni seriali della risultante sospensione cellulare splenica sono state seminate in doppio su piastre Triptone Agar (Oxoid Ltd, Basingstoke, UK) contenenti appropriati antibiotici.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Dei 191 vitelli bufalini esaminati, 62 (32.5%) sono risultati positivi alla ricerca di Salmonella spp. mediante metodo colturale. Tutti i ceppi di S. Typhimurium raccolti nel presente studio sono stati isolati in corso di patologia ed in assenza di altri agenti eziologici (E. coli, Criptosporidium spp., Giardia spp., coronavirus, rotavirus e C. perfringens) causa di sindrome gastroenterica nel vitello bufalino. Tali isolati sono stati ulteriormente tipizzati mediante metodo molecolare andando a ricercare geni i cui prodotti plausibilmente svolgono un ruolo nella patogenicità del batterio. In particolare, i loci gipA, gtgB, sopE, sodC1, gtgE, gogB, sspH1 e sspH2, sono geni di origine fagica che codificano per fattori di virulenza (1,2,4,6,7); Il gene spvC è situato su un noto plasmide di virulenza (2), mentre i geni stfE, safC, csgA, ipfD, bcfC, stbD, pefA, fimA e agfA codificano per dei fattori di adesione (fimbrie) necessari per indurre e sostenere la sindrome gastroenterica (5). Il gene cromosomico invA è stato invece amplificato per ogni isolato come controllo positivo del DNA nelle reazioni di PCR.
Sulla base dei 18 loci analizzati, in funzione della presenza/assenza dei geni ricercati, i 14 ceppi di S. Typhimurium hanno mostrato 10 genotipi diversi. Questo risultato conferma l’estrema variabilità presente nell’ambito del sierotipo Typhimurium (4,7) ed evidenzia il grande potere discriminante della genotipizzazione effettuata. Tra gli isolati di Salmonella raccolti sono stati scelti 3 ceppi per le successive prove di competizione in vivo nel topo. A tale scopo sono stati testati i due ceppi che esibivano rispettivamente il maggiore (ceppo # 92) e il minore (ceppo # 112) numero di fattori di virulenza, ed un ulteriore ceppo (# 16) con un corredo genotipico simile al ceppo # 92, senza però il locus agfA. I risultati delle prove di competizione indicano che il ceppo # 92 (ovvero quello con il maggior numero di fattori di virulenza) risulta essere il più virulento di quelli considerati. I risultati di questo studio consentono di chiarire alcuni aspetti della salmonellosi bufalina. In primo luogo, la prevalenza di Salmonella spp. in vitelli bufalini affetti da sindrome gastroenterica appare significativa, essendo stato isolato tale patogeno nel 32.5% dei casi. Inoltre, la distribuzione dei sierotipi nell’ambito di questa specie animale appare estremamente variabile, con una maggiore prevalenza di S. Typhimurium (23%), S. Muenster (11%)
e S. Give (10%). Questi dati confermano l’assenza di un sierotipo specificamente adattato alla specie bufalina (5).
La sindrome gastroenterica indotta da Salmonella è tra le principali cause di mortalità nei vitelli bufalini, pertanto, una corretta caratterizzazione degli isolati e’ cruciale nella prevenzione e nel controllo degli episodi infettivi. La caratterizzazione genotipica condotta in questo studio ha confermato la variabilità genetica dei ceppi, mostrando una capacità di discriminazione nell’ambito del sierotipo S. Typhimurium del 71%. Le prove di competizione in vivo nel topo confermano inoltre la variabilità fenotipica di questo patogeno. L’analisi dei profili genetici esibiti dai ceppi inclusi nelle prove in vivo evidenzia che il ceppo più virulento si distingue dagli altri per la presenza di un numero elevato di fattori di virulenza e del gene agfA, codificante per un fattore di adesione fimbriale (“aggregative fimbria A”). Sulla base di questi dati, è ipotizzabile che tale fimbria svolga un ruolo essenziale nell’induzione della sindrome gastroenterica, aumentando pertanto il potere patogeno del batterio portatore. Altri studi, tuttavia, saranno necessari per escludere la possibilità che le differenze fenotipiche osservate tra i ceppi in esame non dipendano in realtà da altri fattori di virulenza non inclusi in questo studio. In conclusione, la tipizzazione molecolare effettuata ha mostrato di fornire utili informazioni in merito alla virulenza di Salmonella, e la sua applicazione potrebbe contribuire ad una migliore comprensione del ruolo di questo patogeno nell’eziologia della sindrome gastroenterica nel vitello bufalino.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
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10) Norma UNI EN ISO 6579:2002, Annex D “Detection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental samples from primary production stage”.