Bozzetta E., Pezzolato M., Cencetti E., Meloni D., Abramo F. 1, Mutinelli F.,2 Ingravalle F., Teneggi E.M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta- SC Istopatologia e Test Rapidi, Torino
1Dipartimento di Patologia Animale, Profilassi e Igiene degli alimenti - Università degli studi di Pisa 2Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie-Laboratorio Istopatologia, Legnaro, –, Padova
Key words: : Histopathology, fish, fresh/ frozen, fraud
SUMMARY
Authentication of the condition of fish as fresh or thawed is compulsory, according to EU Regulations 104/2000 and 2065/01, both to avoid frauds in retailing frozen fish as fresh, and for food safety, with regards to the microbiological risk in thawed products. Besides this freezing is mandatory according to EU Regulation 853/2004 to prevent infestation from nematodes in fish intended for raw consumption. We developed a robust and accurate histological method to distinguish between fresh and frozen/thawed fish to be adopted in official laboratories for fraud monitoring.
INTRODUZIONE
La crescente domanda in qualità e salubrità degli alimenti richiede metodi diagnostici innovativi sia per verificare la rispondenza dei prodotti alla legislazione vigente sia per informare correttamente il consumatore. A questo proposito l’autenticazione del pesce come fresco/congelato è obbligatoria in base ai Regolamenti EU 104/2000 (2) e 2065/01(3), sia per prevenire le frodi commerciali che comportano la vendita di pesce pregiato come fresco anche se scongelato, sia per ridurre il rischio microbiologico legato a procedure di congelamento, stoccaggio e scongelamento non propriamente eseguite. La frode è comunemente perpetrata soprattutto nella vendita al dettaglio per prolungare la vita commerciale delle specie più pregiate.
D’altra parte il trattamento con abbattitore termico per non meno di 24 ore a -20°C è prescritto per tutti i prodotti ittici destinati al consumo come crudi o soggetti ad un trattamento considerato inefficace nel prevenire problematiche sanitarie del consumatore relative alla potenziale infestazione da parte di nematodi. L’Anisakiasi è la nematodiasi più diffusa nel Mar Mediterraneo, con prevalenze d’infestazione fino al 70% (1) in alcune specie di largo consumo.
La dichiarazione non corretta dello stato di conservazione del pesce rappresenta una frode frequente ai danni del consumatore, a causa della mancanza di metodi efficaci di identificazione da parte del veterinario ispettore o comunque non dotati delle caratteristiche di accuratezza indispensabili a farne uno strumento di indagine affidabile. Scopo del presente lavoro è verificare le performance del test istologico per identificare lo stato di conservazione del pesce (fresco/congelato), verificandone la
rispondenza ai requisiti di un metodo di screening ufficiale come richiesto dal Regolamento 882/2004.
MATERIALI E METODI
Sono stati campionati dal Mar Ligure le seguenti specie: orata (Sparus auratus), triglia (Mullus barbatus) e pesce spada (Xiphias gladius). Centoquarantadue campioni di muscolo di ogni specie sono stati tagliati in sezioni di 0.5 cm di spessore: una metà di ciascun campione è stata fissata in formalina immediatamente, l’altra è stata ripartita in 3 gruppi per ogni specie; i tre gruppi sono stati congelati per 12 ore a -80°C e poi stoccati a -20°C per periodi diversi (15, 30 e 42 giorni); infine tutti i campioni sono stati scongelati a – 4°C per 12 ore e quindi fissati in formalina. Ogni campione è stato tagliato in 3 parti e ognuna di queste posta in una biocassetta identificata con numero progressivo e un numero da 1 a 3. Una procedura operativa standard (POS) che descrive la metodologia di campionamento, di processazione, di colorazione e lettura è stata allestita e distribuita con i campioni a 3 laboratori istologici italiani deputati alla diagnosi delle malattie dei pesci e ai controlli in ambito di sicurezza degli alimenti. Ogni campione è stato localmente processato, tagliato al microtomo e colorato in ematossilina-eosina. Le sezioni sono state osservate al microscopio ottico a 10X da un istopatologo esperto e classificate come positive (congelate) o negative (fresche). La dimensione campionaria è stata determinata ipotizzando sensibilità e specificità del metodo pari a 0.9 e un errore massimo di 0.1. I risultati delle letture sono stati inseriti in un dataset da ogni laboratorio e analizzati utilizzando STATA 10.1.
In seguito ai risultati conseguiti è stato effettuato un ulteriore campionamento di 35 specie di pesci diverse per verificare se i criteri diagnostici adottati nel primo studio potessero essere estesi a tutte le specie nonché alla valutazione dell’avvenuto processo di congelamento richiesto ai fini della bonifica dei prodotti ittici da potenziali infestazioni (-20°C per 24 ore). A tal fine sono stati analizzati 113 campioni in parte immediatamente fissati in formalina ed in parte sottoposti a congelamento a -20°C per 24 ore e a -80° per 24 ore. In seguito tutti i campioni sono stati scongelati e fissati in formalina. Ogni campione è stato riposto in una biocassetta, identificato con numero progressivo, quindi processato per l’esame istologico in base alla POS dedicata. I
preparati sono stati osservati da 3 lettori esperti. La dimensione campionaria è stata calcolata in 101 campioni, poi innalzata a 113 per evitare perdite di risultati. Il valore è stato ottenuto ipotizzando un k pari a 0.75 e la stessa proporzione, pari a 0.75, di campioni valutati come positivi da tutti gli esperti con una precisione assoluta di 0.15
RISULTATI
La Fig. 1 illustra il quadro istopatologico riscontrato in condizioni di freschezza e congelamento: nel secondo caso si osservano, a livello citoplasmatico, spazi a margini netti otticamente vuoti. I risultati di accuratezza e precisione del metodo relativamente al primo studio evidenziano elevati valori di sensibilità e specificità per tutti e 3 i laboratori ed anche la concordanza risulta ottima avendo 0.87 come limite inferiore dell’intervallo di confidenza (Tab.1 e 2). Durante le analisi condotte sui campioni del secondo esperimento si sono riscontrati in una piccola percentuale di campioni quadri microscopici non sicuramente riferibili né a congelamento né a freschezza, rendendo così necessaria l’introduzione di una nuova classe “non conclusivo (NC)”. I risultati delle letture sono riportati nelle tab. 3 e 4.
Kappa-combined (95%CI): 0,93 (0,87 – 0,98)
Kappa-combined (95%CI): 0,66 (0,57 – 0,75)
Sensibilità media 94,57% (95%IC: 87,62% -98,11%); Specificità media 97,53% (95%IC: 83,39% - 99,70%)
Fig.1. Orata (Sparus aurata). Sezione istologica di muscolo colorata con ematossilina-eosina: a- fresco; b-congelato
CONCLUSIONI E DISCUSSIONE
Dichiarare in etichetta lo stato di conservazione del prodotto ittico è obbligatorio sia al fine di rispondere ai requisiti legislativi sia per rassicurare il consumatore. La vendita di prodotto ittico congelato per fresco è una frode sia commerciale, sia sanitaria, così come la vendita di pesce destinata al consumo tal quale (es. carpaccio, sushi) non sottoposta ad abbattimento termico. Abbiamo sviluppato un metodo diagnostico semplice ed efficace nell’identificare correttamente lo stato di conservazione del prodotto ittico.
Nella valutazione sono state incluse sia le specie di largo consumo in Italia che quelle con caratteristiche di composizione in grasso e proteine molto diverse, ai fini di valutare la robustezza del metodo su varie matrici.
I risultati ottenuti dimostrano che l’esame istologico è uno strumento molto accurato per distinguere il pesce fresco dal pesce decongelato, indipendentemente dalla specie in esame. Inoltre i laboratori coinvolti nello studio hanno ottenuto ottimi risultati sia di accuratezza che di precisione pur avendo eseguito le analisi senza essere stati sottoposti ad una preventiva formazione. La metodica, in corso di accreditamento, risulta quindi idonea per la prossima adozione nei piani di controllo ufficiale. Ulteriori ricerche saranno finalizzate ad ottimizzare il metodo anche su matrice soggetta a trattamento di marinatura o affumicatura e a ridurre al minimo la durata dell’analisi, al fine di poterla applicare entro i limiti di vita commerciale del prodotto.
RINGRAZIAMENTI
La ricerca è stata parzialmente finanziata dal Ministero della Salute IZSPLV 06/07RC.
Si ringraziano i veterinari ispettori per i prelievi sul territorio (Dr. Gili Stefano e Dr. ssa Granatiero Daniela ASLTO1; Dr. Moschi Roberto ASL1 Imperia; Dr. Canova Alessandro ASL3 Genova; Dr. Dini Valter ASL2 Savona; Dr. Orlandi Mino ASL5 La Spezia)
BIBLIOGRAFIA
1. Puente P., Anadaon A.M., Rodero M., Romaris F., Ubeira F.M., Cuellar M. (2008). Anisakis simplex: the high prevalence in Madrid and its relation with fish consumption. Experimenatl Parsit., 118:271-271
2. Regolamento (ce) n. 104/2000 del Consiglio del 17/12/ 1999 relativo all’organizzazione comune dei mercati nel settore dei prodotti della pesca e dell’acquacoltura
3. Regolamento (CE) n. 2065/2001 della Commissione del 22/10/ 2001 che stabilisce le modalità d’applicazione del regolamento (CE) n. 104/2000 del Consiglio per quanto concerne l’informazione dei consumatori nel settore dei prodotti della pesca e dell’acquacoltura