Chiaravalle A. E., Miedico O., Laconca L., Pompa C., Tarallo M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, Foggia
Key words: monitoraggio, metalli pesanti, DRC-ICP-MS
SUMMARY
A monitoring study on the presence of metals in feed for different animal species was carried out using an inducted coupled plasma mass spectrometry (ICP/MS). A total of 57 samples of different types were analyzed and the concentrations of the four contaminants ( Hg, Pb, Cd and As) were compared with the law limits concentrations according to the Directive CE 32/2002, while the concentrations of principle oligo-elements (Se, Fe, Cu, Zn, and Mn) were compared with the values reported in the etiquette of these products.
INTRODUZIONE
L’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata è un ente sanitario di diritto pubblico facente parte del Servizio Sanitario Nazionale quale strumento tecnico ed operativo per la sanità animale, il controllo della salute e qualità degli alimenti di origine animale, l’igiene degli allevamenti ed attività correlate. La Struttura Complessa CHIMICA di codesto Istituto è deputata, tra gli altri compiti, al controllo ufficiale di alimenti e mangimi. Tale controllo è attuato mediante specifici piani di monitoraggio come il Piano Nazionale Residui (PNR) relativo agli alimenti destinati all’uomo e il Piano Nazionale di vigilanza e controllo sanitario sull’Alimentazione Animale (PNAA), relativo ai mangimi. Lo scopo è assicurare, in accordo a quanto già stabilito dal Reg. CE 882/2004, un sistema ufficiale di controllo dei mangimi lungo l’intera filiera alimentare al fine di garantire un elevato livello di protezione e di salute per gli animali e per l’uomo.
Ogni anno vengono eseguite sulle diverse tipologie di mangimi, prelevati dal Servizio Sanitario Locale, le analisi dei principali contaminanti quali Piombo (Pb), Cadmio (Cd), Mercurio (Hg) e Arsenico (As), i cui tenori massimi sono stabiliti dalla Direttiva CE 32/2002 e s.m.i. Inoltre vengono determinati e quantificati i principali oligoelementi quali Selenio (Se), Rame (Cu), Zinco (Zn), Ferro (Fe), Manganese (Mn), fondamentali per i vari processi fisiologici dell’animale.
Il presente lavoro mostra i risultati ottenuti su campioni di mangime pervenuti presso codesto Istituto tra il 2° semestre 2010 e il 1° semestre 2011.
MATERIALI E METODI
Campioni analizzati: Per lo studio di monitoraggio sono stati analizzati 57 campioni di mangimi commercializzati in Puglia di cui 12 destinati all’alimentazione per ovi-caprini, 18 destinati a bovini, 5 a suini, 5 ad equini, 5 a pollame, 7 a conigli, 2 a pesci, 1 agli animali da compagnia e 2 destinati a più specie animali. La tipologia dei mangimi analizzati è varia: sono prevalentemente mangimi complementari, completi e sfarinati, dove per complementari si intendono miscele di mangimi che contengono tassi elevati di alcune sostanze e che, per la loro composizione, assicurano la razione giornaliera soltanto se associati ad altri mangimi; per completi si intendono miscele di mangimi che da soli bastano ad assicurare una razione giornaliera; infine col termine sfarinati ci si riferisce a quelle materie prime (cereali) che vengono ridotti a farina o polvere. Le analisi chimiche effettuate
includono la ricerca di metalli pesanti ed oligoelementi utilizzando un metodo preventivamente validato presso il laboratorio della struttura semplice “Metalli Pesanti e Mangimi” del suddetto Istituto.
Preparazione del campione: La preparazione di ogni singolo campione ha previsto due passaggi fondamentali: omogeneizzazione e mineralizzazione. Nello specifico, circa 500 g di mangime sono stati macinati ed omogeneizzati mediante mulino a coltelli (modello FRITSCH Pulverisette 14 congriglia di diametro 0.5 mm); di questi, 0,50 g pesati su bilancia analitica e mineralizzati con 8 ml di acido nitrico, 2 ml di perossido di idrogeno e 100 μl di acido fluoridrico, utilizzando un forno a microonde. Poiché la Normativa vigente impone di esprimere i risultati su un campione con tasso di umidità del 12%, si precisa che i risultati sono stati corretti per il contenuto di acqua libera proprio di ogni campione, determinato sperimentalmente secondo una appropriata procedura analitica (5,0 g in stufa a 103° C per circa 4 ore, secondo quanto previsto dal Reg. CE 152/2009).
Modalità di lettura: Dopo ottimizzazione delle condizioni operative e verifica delle performance strumentali, è stata effettuata la taratura esterna con range di calibrazione specifico per ogni elemento. Tutti i campioni sono stati diluiti di 4 volte per assicurare la stabilità della lettura strumentale e per rientrare nell’intervallo di taratura di ciascun elemento. La determinazione di Pb, Cd, Hg, Sn ed As, è stata eseguita in modalità STANDARD mentre per tutti gli altri analiti è stata adoperata la modalità con l’uso della cella dinamica di reazione (DRC) per eliminare selettivamente gli ioni interferenti isobari. Per ogni campione è stata effettuata l’analisi in doppio.
RISULTATI E DISCUSSIONI
Nella Tabella 1 sono riportati i risultati delle analisi dei contaminanti inorganici, tra i quali i piú importanti sono regolamentati dalla Direttiva CE 32/2002: Pb, Cd, Hg e As. Si precisa che sono indicati i valori medi e il numero di campioni per ciascuna categoria di mangime. Tipologia Mangime (N° campioni)
Hg
Cd
Pb
As
Cr
Ni
OVI-CAPRINI (12) <LOQ 0,0621 0,270 0,146 1,431 2,310 BOVINI (18) <LOQ 0,0838 0,231 0,116 2,227 6,970 SUINI (5) <LOQ 0,0772 0,242 0,121 2,821 1,940 EQUINI (5) <LOQ 0,0520 0,430 0,136 1,007 1,375 POLLAME (5) <LOQ 0,0922 0,083 0,115 4,052 2,200 CONIGLI (7) <LOQ 0,0906 0,542 0,201 3,730 2,760 PESCI (2) 39,4 0,4354 2,503 2,415 1,273 1,250 TUTTI (2) <LOQ 0,0209 0,084 0,053 2,850 2,040 DA COMPAGNIA (1) <LOQ 0,0499 0,209 0,491 1,261 1,130Tabella 1: Concentrazione dei principali contaminanti inorganici,
Si nota che il contenuto di mercurio per tutti i campioni è risultato inferiore al Limite di Quantificazione (LOQ=0,025 mg/kg), ad eccezione del mangime per pesci, il cui tenore è di circa 0,040 mg/kg. Tale eccezione è da attribuirsi alla diversa natura della matrice, in quanto tali mangimi hanno in genere composizione mista (farine animali, olio e farine di pesce, glutine di frumento e/o granturco), che comprende anche derivati ittici a più elevato tenore di mercurio. Anche il tenore medio di Piombo per ogni tipologia di mangime è risultato notevolmente al di sotto dei limiti di legge, che vanno dai 10,0 mg/kg per le materie prime, ai 10,0 mg/kg dei mangimi complementari, ai 5,0 mg/kg per i mangimi completi. Anche per questo analita, il campione di mangime per pesci risulta molto più contaminato (2,5 mg/kg), pur non superando il limite imposto. Infine, anche per Cadmio e Arsenico possono valere le medesime considerazioni, in quanto i tenori medi non superano 0,10 e 0,50 mg/kg rispettivamente, ad eccezione ancora una volta del mangime per pesci, per il quale la succitata Direttiva ammette un limite di 10,0 mg/kg di Arsenico.
Grafico 1: Concentrazione dei contaminanti (Cd, Pb, As),
espressa in mg/kg, nelle varie tipologie di mangime
Oltre alle considerazioni già riportate, dal Grafico 1 si denota una certa variabilità nel contenuto medio di Piombo tra le varie tipologie prese in esame. In particolare, i mangimi per equini e per conigli presentano un contenuto di questo contaminante sensibilmente maggiore rispetto alle altre categorie, che sono invece meno contaminate e più omogenee tra di loro (ovi-caprini, bovini, suini e animali da compagnia). Invece, per il Cadmio la distribuzione è decisamente meno variabile tra i diversi mangimi. Nella Tabella 2 sono riportati i risultati degli oligoelementi considerati nella Comunicazione della Commissione 2004/C 50/01 e nel Reg CE 767/2009 (Selenio, Ferro, Rame, Zinco e Manganese). Tipologia Mangime (N° campioni)
Cu
Se
Mn
Zn
Fe
OVI-CAPRINI (12) 11,5 0,362 123 128 277 BOVINI (18) 20,2 0,354 128 131 387 SUINI (5) 17,7 0,368 83 94 272 EQUINI (5) 12,8 0,451 104 77 462 POLLAME (5) 14,6 0,250 148 91 220 CONIGLI (7) 18,7 0,294 141 107 588 PESCI (2) 17,9 1,632 58 215 400 TUTTI (2) 4,5 0,081 21 19 110 DA COMPAGNIA (1) 18,0 0,319 62 139 403Tabella 2: Concentrazione dei principali oligoelementi,
espressa in mg/kg, nelle diverse tipologie di mangime
Tutti i campioni oggetto del presente monitoraggio sono corredati da relativo cartellino descrittivo di composizione. La maggior parte di essi riporta un valore dichiarato di Selenio inorganico additivato pari a 0,50 mg/kg. Come si può osservare dai risultati riportati nella precedente tabella, i tenori medi misurati sono compatibili, entro le tolleranze consentite, con quanto dichiarato dai produttori; tuttavia si registra per tutte le tipologie esaminate un tenore sistematicamente inferiore al dichiarato. Per i mangimi destinati a più specie animali, il tenore di selenio è inferiore a 0,10 mg/kg, compatibilmente a quanto riportato nell’etichetta (tale oligoelemento non risulta additivato).
Tutti i mangimi analizzati presentano un contenuto di Rame simile a quanto riportato in etichetta (tra 12 e 20 mg/kg), ad eccezione dei mangimi destinati a più specie, in cui non risulta nessuna additivazione. Per quanto concerne lo Zinco, il contenuto di questo oligoelemento nei mangimi destinati a tutte le specie è nettamente inferiore (19 mg/kg) rispetto agli altri mangimi, in particolare ai mangimi per pesci che presentano un contenuto di Zinco pari a 215 mg/kg, quindi circa 10 volte superiore. Si nota che i mangimi destinati a più specie animali hanno un contenuto complessivo di tutti e cinque gli oligoelementi (Cu, Se, Mn, Zn, Fe) molto più basso rispetto alle altre tipologie esaminate, in accordo alle differenti esigenze nutrizionali delle specie a cui sono destinati.
Grafico 2: Concentrazione di oligoelementi (Cu, Mn, Zn),
espressa in mg/kg, nelle diverse tipologie di mangime Infine per quanto riguarda Manganese e Ferro occorre sottolineare che le quantità riscontrate in ciascun campione sono nettamente superiori alle concentrazioni di additivazione dichiarate nell’etichetta, a causa della notevole quantità di analita “nativo”. Ciò nasconde un problema di tipo applicativo delle norme in quanto i Regolamenti in vigore si riferiscono esclusivamente alle quantità additivate e non alla quantità totale di analita presente.
CONCLUSIONI
In questo lavoro è stato monitorato, sulla matrice mangime, il tenore dei matalli pesanti, quali principali contaminanti inorganici di tali matrici, e degli oligoelemementi, necessari per i processi fisiologici dell’animale. Il contenuto dei conta- minanti (Pb, Cd, Hg e As) è risultato, seppure con una certa variabilità tra le diverse tipologie di mangimi esaminati, al di sotto dei limiti imposti dalla legge, a testimonianza del discreto stato igienico sanitario degli allevamenti in Italia ed
in particolare nelle zone direttamente controllate da codesto Istituto. Inoltre, il contenuto di oligoelementi (Se, Fe, Cu, Zn e Mn) è risultato conforme a quanto riportato nell’etichetta di ciascun campione, in particolare per quanto concerne il con- tenuto di Selenio, dove però bisogna registrare un sistema- tico scostamento per difetto dalla concentrazione dichiarata in etichetta. Pertanto, il presente lavoro, reso possibile sulla base dell’attività istituzionale dell’ IZS di Puglia e Basilicata, consente di avere una visione globale sullo stato sia dei li- velli di contaminazione degli alimenti ad uso zootecnico sia della concordanza tra quanto dichiarato in etichetta dai pro- duttori di mangime e quanto realmente riscontrato nei singoli
campioni. Infine, occorre sottolineare il contributo scientifico per una maggiore conoscenza dei problemi tipici del setto- re mangimistico, allo scopo di sollecitare un aggiornamento delle attuali norme legislative.
BIBLIOGRAFIA
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CONTAMINAZIONE AMBIENTALE DA DEIEZIONI DI CANI: PROBLEMA DI SALUTE PUBBLICA?
Cinquepalmi V.,1 D’Amato F.2, Monno R.2, De Vito D.2, Soleo L.11 Dip. Medicina Interna e Medicina Pubblica, 2 Dip di Odontostomatologia e Chirurgia, Università degli Studi di Bari “Aldo Moro”, Bari.
Key words: zoonosi, antibiotico – resistenza.
ABSTRACT
Pet animals and dogs in particular have increased in modern society. Dogs may have a potential for zoonotic infections and may represent a reservoir of bacteria resistant to antibiotics. We have analyzed 418 fecal samples of dogs collected on the streets of Bari, Italy for the presence of some bacteria and Giardia spp. Campylobacter, Salmonella, Yersinia were never isolated. Giardia was present in the 1.9 % of samples. Enterococcus spp. resistant to several class of antibiotics, including vancomycin, were also isolated. Only in 3 occasion MRSA strains, resistant to several antibiotics, were identified. Our data showed that public areas are contamined with potentially pathogens and multiresistant strains of Gram positive bacteria representing a problem for the public health.
INTRODUZIONE
Nei paesi industrializzati il numero degli animali da compagnia è in aumento. Conseguentemente in alcune città è aumentato il numero di escrementi di cani lasciati per strada dai possessori degli stessi. Questo potrebbe rappresentare un problema di salute pubblica in quanto gli escrementi dei cani possono contenere e veicolare diversi microorganismi potenzialmente patogeni per l’uomo nonché batteri resistenti agli antibiotici trasmissibili all’ uomo (1- 3,5-7).
Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare la presenza di alcuni microorganismi potenzialmente patogeni per l’ uomo e di ceppi di batteri Gram - Positivi nonché la loro resistenza agli antibiotici in campioni di feci di cane.
MATERIALI E METODI
418 campioni di feci raccolti nelle strade di diversi quartieri della città di Bari sono stati testati per la presenza di Salmonella, Campylobacter, Yersinia con metodi tradizionali. La presenza di Giardia è stata valutata in 418 campioni con microscopia diretta e in 208 anche con metodo immunoenzimatico. Sono stati inoltre ricercati batteri appartenti al genere Enterococcus e Staphylococcus aureus resistenti alla meticillina. I ceppi di Enterococcus sono stati testati per la sensibilità ad un pannello di antibiotici con metodo di Kirby - Bauer . Metodi molecolari sono stati utilizzati per la conferma del genotipo di resistenza in Enterococcus spp. con metodiche precedentemente descritte (4).
RISULTATI E DISCUSSIONE
Nessuno dei campioni esaminati è risultato positivo alla ricerca di Salmonella, Campylobacter e Yersinia. Giardia spp. è stata rilevata , con metodo immunoenzimatico, in 4 dei 208 campioni esaminati (1.9 %). In un campione furono occasionalmente riscontrate uova di Toxocara spp.
73 ceppi di Enterococcus spp. furono isolati da 68 campioni fecali. Le specie più frequentemente isolate sono state, nell’ ordine: E. faecium ( 45/73, 61.6 %), E. gallinarum ( 17/73, 23.3 %), E. casseliflavus ( 4/73,.5.5%). Altre specie, incluso lo E. faecalis furono isolate con percentuali dell’ 1-2 %.
I ceppi di Enterococcus spp sono risultati resistenti, nell’ ordine, ai seguenti antibiotici: clindamicina (86.3%), tetraciclina (65.7 %), eritromicina ( 60.3%), ampicillina (47.9 %), penicillina (46.6%), piperacillina – tazobactam (43.8 %), amoxicillina - acido clavulanico (34%) e levofloxacina (23.3% ). Una bassa percentuale di ceppi resistenti al cloramfenicolo ( 1.4%) e’ stata riscontrata .
La vancomicina - resistenza fu identificata nel 4.1 % dei ceppi di Enterococcus spp. ed in particolare in 2 ceppi di E. avium e in un ceppo di E. durans. Gli stessi ceppi sono risultati anche resistenti alla teicoplanina.
Indagini molecolari hanno confermato la identificazione biochimica dei ceppi di E. gallinarum in quanto, come è descritto in letteratura, questi ceppi possedevano il gene VanC1 e mancavano del gene VanC2-VanC3. Le stesse metodiche molecolari hanno confermato l’identificazione dei ceppi di E. casseliflavus in quanto era presente il gene VanC2-VanC3 .
Solo in tre campioni di feci , pari allo 0.7%, furono isolati ceppi di Staphylococcus aureus che risultarono resistenti alla meticillina (MRSA). Inoltre questi ceppi risultarono resistenti non solo agli antibiotici beta-lattamici saggiati, caratteristica dei ceppi MRSA, ma anche ai carbapenemici saggiati ( imipenem, meropenem ed ertapenem ), alla tetraciclina , clindamicina ed eritromicina. 2 ceppi risultarono resistenti agli aminoglucosidi testati (amikacina e gentamicina) e tutti i 3 ceppi risultarono sensibili al cotrimossazolo e alla vancomicina e teicoplanina con MIC < 1mg/L .
In precedenti lavori Giardia spp. è stata identificata dal 19 % dei cani, sia pets che ricoverati in un canile in Toscana. La presenza da noi riscontrata, del 1.9% dei campioni suggerisce il ruolo dei cani come potenziale reservoir in ambiente cittadino, con possibili infezioni soprattutto in età pediatrica ( 1 ).
I ceppi di Enterococcus sono risultati resistenti alla vancomicina nel 4% dei casi e con una resistenza tra 86 % e 40% ad altri antibiotici. Anche se in particolare la vancomicina - resistenza è stata riscontrata in E. avium e in E. durans, specie raramente responsabili di infezioni nell’uomo, la possibilità di trasferimento di geni di resistenza ad E. faecalis ed E.faecium , più frequentemente isolati da infezioni umane , non può essere esclusa.
Sono stati condotti pochi studi sulla presenza di MRSA in animali da compagnia (7). Noi li abbiamo isolati solo in 3 campioni. I due ceppi presentavano inoltre multi resistenza a varie classi di antibiotici inclusi i carbapenemici, tetracicline, e a clindamicina ed eritromicina.
I campioni di feci da noi esaminati erano di recente e/o di vecchia deposizione e questo può aver ridotto il numero dei ceppi di S.aureus isolati, anche se si ritiene che lo S.aureus sia , tra i batteri asporigeni, uno tra i più resistenti. Ulteriori studi su tamponi rettali potranno indicare la reale incidenza di
MRSA in animali da compagnia. La presenza di MRSA in feci di cane, tenendo conto che i pets sono a stretto contatto con i loro possessori, fa ipotizzare una trasmissione di questi ceppi all’uomo o viceversa nonché la loro diffusione nell’ambiente (7). Inoltre anche ceppi di stafilococchi coagulasi-negativi, non sistematicamente ricercati in questo studio, sono risultati resistenti alla meticillina, a conferma del ruolo dei cani di compagnia come reservoir di ceppi resistenti agli antibiotici. I nostri dati confermano la presenza di protozoi potenzialmente patogeni,come peraltro di recente dimostrato da altri autori ( 9 ) nonché la presenza di ceppi resistenti agli antibiotici (1) in feci di cani presenti in ambiente urbano della nostra città, il che dovrebbe richiedere maggiori attenzione da parte delle autorità competenti rappresentando un problema per la salute pubblica.
BIBLIOGRAFIA
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