1Corrò M., 2Rota A., 3Milani C., 1Drigo I., 1Perin R., 4Börjesson S.
1Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Legnaro (PD); 2Dipartimento di Patologia Animale, Facoltà di Medicina Veterinaria,
Grugliasco (TO); 3Dipartimento di Scienze Cliniche Veterinarie, Facoltà di Medicina Veterinaria, Legnaro (PD); 4Deparment of Animal
Health and Antimicrobial Strategies, National Veterinary Institute (SVA) Uppsala (S)
Key-word: MRSP, caratterizzazione genetica, cani da riproduzione.
ABSTRACT
This study was carried out in a breeding kennel where antimicrobial agents were used on bitches around parturition, without any veterinary control. Swabs from 5 body areas and milk of 8 bitches were analysed and Staphylococcus pseudintermedius was isolated. Susceptibility to antimicrobials, presence of mecA gene and genetic characterization on MRSP strains were carried out. Sixteen out of the 29 S.pseudintermedius strains isolated from 5 bitches were MRSP. All MRSP strains resulted multi-drugs resistant, spa-type t02 and carried SSCmec II-III. PGFE showed that they were related and belonged to the major clone lineage dominating in Europe, the ST71-J-t02-II-III.
INTRODUZIONE
L’uso improprio di antibiotici negli allevamenti di cani, specialmente nelle fattrici nel periodo del parto al fine di ridurre la mortalità neonatale, può portare alla selezione di ceppi batterici resistenti (7). Negli ultimi anni si segnala un preoccupante aumento della frequenza d’isolamento di ceppi di Staphylococcus sp. coagulasi positivi meticillino- resistenti nell’uomo e negli animali. La resistenza alla meticillina è dovuta alla presenza del gene mecA, che codifica la sintesi di una proteina di membrana alterata, caratterizzata da scarsa affinità per gli antibiotici β-lattamici. Lo stafilococco coagulasi positivo più diffuso nel cane è S. pseudintermedius, componente della normale flora microbica di cute e mucose e occasionalmente responsabile d’infezioni. Ceppi meticillino-resistenti di tale specie (MRSP) sono stati isolati sia da animali con ferite infette, dermatiti, otiti, sia da soggetti sani (7, 10). I ceppi MRSP isolati in Europa mostrano caratteristiche genetiche molto simili tra loro, pertanto si ipotizza derivino da un clone unico mutato. Tali ceppi presentano inoltre resistenze a un numero elevato di antibiotici appartenenti a famiglie farmacologiche diverse (multi-resistenza) (2) e rappresentano pertanto un serio problema per la sanità animale. Non è esclusa inoltre la possibilità che possano essere trasmessi all’uomo (2, 10) o che possano costituire un serbatoio di resistenze trasmissibili ad altre specie batteriche saprofite o patogene per animali e uomo.
Scopo del lavoro è stato quello di evidenziare la presenza di ceppi MRSP in una popolazione di cani da riproduzione, ospitati in un allevamento che da anni fa largo uso di antibiotici e di confrontare le loro caratteristiche genetiche con quelle di altri ceppi MRSP isolati in Italia e in Europa.
MATERIALI E METODI
L’allevamento oggetto dello studio, situato nel Veneto, ospita in media 11 femmine e 4 maschi di razza Boxer; nel corso dell’anno si hanno circa una decina di parti. I cani vivono in box singoli, ma condividono spazi comuni per
l’esercizio all’aperto. Per ridurre la mortalità neonatale, sono stati utilizzati, negli anni, diversi antibiotici nelle fattrici in prossimità del parto (cefalosporine di III generazione, fluorchinoloni, macrolidi), per lo più somministrati su iniziativa dell’allevatore senza controllo veterinario. Per l’isolamento e l’identificazione degli stafilococchi coagulasi positivi, si sono eseguiti tamponi da narici, bocca, capezzoli, cute delle ascelle, vagina dalle 8 fattrici presenti in allevamento al momento dell’indagine e sono stati prelevati campioni di latte dai due soggetti in lattazione. I campioni sono stati seminati in Agar Sangue con 5% di sangue di montone e incubati in aerobiosi a 37°C per 24 ore. Per l’identificazione di genere e di specie si sono utilizzate prove biochimiche e biomolecolari: test della coagulasi; identificazione fenotipica mediante API Staph 32 ID (BioMérieux, France), PCR per conferma di specie (1, 7). I ceppi isolati sono stati saggiati per valutare le caratteristiche di antibiotico-resistenza mediante: a) il test della diffusione in agar (metodo Kirby Bauer): utilizzando un pannello di 15 principi attivi rappresentativi delle principali classi farmacologiche (tabella 2). Per l’esecuzione della metodica, l’interpretazione degli aloni di inibizione alla crescita e il controllo di qualità si sono seguite le linee guida del Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI);
b) prova di crescita su terreno selettivo differenziale ORSAB (Oxacillin Resistance Screening Agar Base, Oxoid, Basingstoke, United Kingdom), addizionato con oxacillina (4µg/ml).
I ceppi resistenti all’oxacillina sono stati sottoposti a PCR per la ricerca del gene mecA (3, 7) per confermare la meticillino- resistenza.
I ceppi MRSP sono stati caratterizzati geneticamente con le metodiche di seguito riportate, applicando i protocolli d’indagine e gli schemi identificativi descritti in bibliografia: 1) Spa-typing (4) con le seguenti sequenze di primer: 5´-AATAATTCA e 3´-GACAAGCG (8).
2) SCCmec types I – V: mediante PCR-RT Multiplex, associata a PCR convenzionale per differenziare SCCmec III lacking SCC-Hg, SCCmec II-III e SCCmec VII-241 (6). 3) Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) (5), seguendo i criteri proposti da Tenover et al. (2009) per i ceppi batterici, per l’interpretazione dei cluster di frammenti di DNA ottenuti in campo pulsato (9).
RISULTATI
In totale sono stati isolati 29 ceppi di stafilococco coagulasi positivo, identificati come S. pseudintermedius; di questi 16 sono risultati oxacillina resistenti e mecA positivi (55%). I ceppi MRSP sono stati isolati da 5 delle 8 fattrici esaminate, ed evidenziati in una o più sedi di prelievo (tabella 1). In particolare in un soggetto, i ceppi MRSP sono stati isolati in alta carica e in coltura pura da tutti i campioni, incluso il latte. In tutti gli altri casi nelle colture batteriche erano
contemporaneamente presenti sia ceppi MRSP, sia ceppi oxacillino-sensibili, mecA negativi.
I risultati dell’antibiogramma eseguito sui ceppi MRSP sono riportati nella tabella 2, caratteristica comune è la resistenza a un ampio numero di antibiotici: 14 su 15 principi attivi saggiati.
La caratterizzazione genetica ha evidenziato che i ceppi MRSP isolati in allevamento sono tra loro indistinguibili e appartengono a un unico clone con le seguenti caratteristiche: spa type t02, SCCmec II-III e lo stesso pulso-tipo evidenziato tramite PFGE.
DISCUSSIONE
L’uso eccessivo di antibiotici nell’allevamento di cani e la somministrazione di routine alle fattrici in prossimità del parto, indipendentemente da problematiche di tipo batterico, sono senza dubbio fattori importanti per la selezione di ceppi MRSP (7). Tuttavia in alcuni allevatori si è radicata la convinzione che tale pratica possa controllare o ridurre la mortalità neonatale; le conseguenze nel tempo sono invece deleterie, perché i ceppi resistenti selezionati nelle fattrici con la somministrazione di farmaci e trasmessi ai cuccioli subito dopo il parto, possono rendere inefficace, in caso di necessità, il futuro utilizzo di antibiotici.
Non si hanno ancora conoscenze sulla persistenza dei ceppi MRSP negli animali e nell’allevamento una volta interrotta la somministrazione dei farmaci, benché alcuni autori siano dell’idea che la loro presenza tenda a ridursi nel tempo fino a scomparire negli animali e nell’ambiente (10).
La caratterizzazione genetica dei ceppi MRSP ha confermato la presenza in allevamento di ceppi originatisi probabilmente da uno stesso clone mutato: ST71-J-t02-II- III che è predominante in Italia e in Europa (6, 8). I ceppi presentano inoltre caratteristiche di multi-resistenza. La presenza di ceppi MRSP negli animali e la loro diffusione nell’ambiente rappresentano un problema emergente in sanità animale poiché vanificano la maggior parte dei protocolli terapeutici applicati in caso di patologia. Non va sottovalutata inoltre l’evenienza che tali microrganismi possano essere trasferiti da un animale all’altro e che l’uomo possa svolgere un ruolo di primaria importanza come vettore meccanico in quegli ambienti dove si verifica uno stretto contatto uomo-animale infetto: ambulatorio veterinario, allevamento, ecc. Poco probabile è invece il rischio che ceppi
MRSP possano provocare direttamente patologie nell’uomo (zoonosi), rare sono, infatti, le segnalazioni in tal senso (2). Più preoccupante è invece l’ipotesi che i fattori di resistenza presenti nei ceppi MRSP possano essere trasferiti ad altre specie batteriche conferendo a quelle patogene per uomo e animali nuove caratteristiche di antibiotico-resistenza. Per tale motivo è di fondamentale importanza un uso consapevole e appropriato del farmaco veterinario al fine di evitare la selezione e la diffusione di ceppi batterici resistenti nell’ambiente.
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Tabella 1: dettaglio isolamenti MRSP dalle fattrici.
Cani MRSP positivi (5/8) Bocca Narici Ascella Capezzoli Vagina Latte
Femmina 9 mesi X X X No Femmina 19 mesi X No Femmina 3 anni X X X X X X Femmina 4 anni X X X X Femmina 10 anni X X No No Totale MRSP 3/6 2/5 3/7 3/6 3/3 2/2 % MRSP 50 40 43 50 100 100
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Tabella 2: Ceppi MRSP profilo di antibiotico-resistenza.
Ceppi MRSP 1-16
Panello principi attivi S/I/R
Penicillina R
Ampicillina R
Amoxicillina-acido clavulanico R
Oxacillina R
Cefalosporine I generazione R
Cefalosporine III generazione R
Spiramicina R Eritromicina R Tilmicosina R Tilosina R Tetraciclina R Licosamidi R Enrofloxacina R Sulfametossazolo-Trimethoprim R Tiamulina S