1De Nadai V., 1Daminelli P., 1Maccabiani G., 1Zanardini N., 2Lavazza A.
1Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Reparto di Microbiologia, Brescia; 2Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna, Reparto di Virologia, Brescia
Key words: E. cuniculi, PCR, diagnosi
SUMMARY
Encephalitozoonosis is a chronic protozoan disease affecting several species of mammals, including lagomorphs and rodents. Despite many studies and surveys it remains a difficult disease to diagnose with certainty especially in vitam. The aim of the study was to validate a PCR method for the detection of E. cuniculi in rabbit kidney. Four PCR methods were set up: three of them described in literature and the last prepared employing primers designed using GenBank sequences. Such reaction showed adequate sensibility and specificity.
INTRODUZIONE
L’encefalitozoonosi è una parassitosi cronica latente sostenuta dal microsporidio Encephalitozoon cunicoli (Gram positivo, sporigeno, parassita intracellulare obbligato), che colpisce diverse specie di mammiferi e in particolare roditori e lagomorfi.
La trasmissione della patologia avviene principalmente per via orale, attraverso l’ingestione di cibo contaminato da feci e soprattutto urine contenenti le spore. In corso di disseminazione si riconoscono una fase acuta con coinvolgimento di polmoni, reni e fegato e una fase cronica in cui gli organi target sono reni, encefalo e cuore.
Le lesioni causate da E. cuniculi interessano principalmente reni ed encefalo, con quadri caratterizzati da nefrite interstiziale di diverso grado e meningoencefalite non suppurativa (5).
Il decorso della patologia ha luogo perlopiù in forma subclinica. Nelle forme clinicamente manifeste si osserva una sintomatologia prevalentemente di tipo nervoso.
La messa a punto di valide tecniche per la diagnosi di E. cuniculi è ancora motivo di studio. Le metodiche in uso nella diagnosi post mortem sono l’esame anatomoistopatologico e l’esame immunoistochimico (2, 3). La conferma della parassitosi in vitam presenta ulteriori limiti in quanto si basa esclusivamente sull’esame sierologico, al quale non è possibile affiancare la valutazione macro e microscopica. Attualmente il tentativo è quello di mettere a punto la tecnica di PCR, già largamente utilizzata in medicina umana, come metodica per la diagnosi di E. cuniculi. Questo permetterebbe di avere a disposizione uno strumento di diagnosi eziologica molto sensibile da utilizzare in sede autoptica su reni, ma anche direttamente dalle urine di animali vivi, sebbene l’eliminazione del parassita sia intermittente.
MATERIALI E METODI
Lo studio è stato eseguito con l’obiettivo di mettere a punto una metodica PCR capace di amplificare materiale genetico specifico di E. cuniculi da reni di coniglio. La reazione ha previsto le fasi di seguito riportate.
1) Estrazione del DNA: utilizzando lo strumento Tissue Lyser (Qiagen) per 10 min a 30.0 Hz, è stata effettuata
una disgregazione meccanica della parete delle spore. Il campione è stato quindi sottoposto a procedura di estrazione specifica per i microrganismi Gram positivi con kit Sigma Bacterial.
2) Preparazione della miscela di reagenti e amplificazione del DNA estratto: sono state testate 4 diverse reazioni di amplificazione, ognuna delle quali caratterizzata da primers specifici, appropriate concentrazioni e volumi dei vari costituenti della miscela di reazione e caratteristici profili termici di amplificazione.
Reazione 1
La miscela di reazione, le sequenze oligonucleotidiche EnceF (5’ - ATG AGA AGT GAT GTG TGT GCG-3’) ed EnceR (5’-TGC CAT GCA CTC ACA GCC ATC - 3’) utilizzate come primers e i profili termici di reazione sono stati eseguiti come descritto da Rossi et al., 1998 (6).
Reazione 2
La medesima coppia di primers è stata utilizzata anche in una reazione caratterizzata da concentrazione dei reagenti della Mastermix e profilo termico leggermente diversi dalla reazione precedente, secondo la descrizione di Valencakova et al. 2005 (7).
Reazione 3
La miscela di reazione, le sequenze oligonucleotidiche EcunF1 (5’ – TCC TAG TAA TAG CGG CTG ACG AA – 3’) ed EcunR2 (5’ – ACT CAG GAC TCA GAC CTT CCG A – 3’) utilizzate come primers e i profili termici di reazione sono stati eseguiti come descritto da Hester et al., 2002 (4). La descrizione del numero di cicli e dei profili termici utilizzati per le reazioni 1-3 è riportata in Tabella 1.
Tabella 1. Descrizione dei profili termici delle reazioni 1-3.
REAZIONE DENATURAZIONE (°C/secondi) ANNEALING (°C/secondi) ESTENSIONE (°C/secondi) 1 94°C/30’’ 55°C /60’’ 72°C/120’’ 35 cicli 2 95°C/45’’ 48°C/60’’ 72°C/60’’ 30 cicli 3 95°C/30’’ 58°C/30’’ 72°C/30’’ 40 cicli Reazione 4
Al fine di ottenere un’adeguata amplificazione del materiale genetico è stata allestita una PCR booster, caratterizzata da due reazioni successive con l’utilizzo dei medesimi primers e reagenti alle stesse concentrazioni.
Volumi e concentrazioni dei reagenti impiegati per la preparazione della Mastermix di ciascuna delle due reazioni sono riportati in Tabella 2.
Tabella 2. Concentrazioni e volumi dei costituenti della miscela di reazione. REAGENTE CONCENTRAZIONE D’USO V O L U M E D’USO (µl) Acqua ultrapura 31 Buffer Gold (10X) 1X 5 MgCl2 (25 mM) 1.5 mM 3 dNTPs (10 mM) 0.8 mM (0.2 mM ciascuno) 4 EculiF (50 µM) 0.8 µM 0.8 EculiR (50 µM) 0.8 µM 0.8 AmpliTaq Gold 250 U (5U/µl) 2 U (0.05 U/µl) 0.4
Per il disegno dei primers sono state valutate le sequenze geniche della specie di interesse pubblicate nella banca dati GenBank, consultabile nel sito del National Centre for Biotecnology Information (8). Le sequenze oligonucleotidiche identificate EculiF (5’ - GAT CGG AAG GTC TGA GTC CTG – 3’) ed EculiR (5’ - CCA AGC TTA TGC TTA AGT TCA AG – 3’) amplificano un frammento della subunità ribosomiale 16 S di E. cuniculi della grandezza di 264 paia di basi. La specificità delle sequenze oligonucleotidiche individuate è stata verificata valutando la percentuale di omologia con il genoma di tutte le altre specie attraverso il programma BLASTn. La sequenza genica adeguata è stato registrata il all’interno della banca dati con codice di accesso GU7354480.1.
Le reazioni di amplificazione sono state condotte in termociclatore GeneAmp PCR System 2700, dopo aver addizionato a 45 µl di Mastermix 5 µl dell’estratto dei campioni, inclusi il bianco di estrazione e il controllo positivo della reazione. Il controllo negativo di PCR è stato allestito aggiungendo alla mix 5 µl di acqua ultrapura.
Il profilo termico della prima reazione ha previsto: Denaturazione: 95°C, 10 minuti
Denaturazione: 94°C, 30 secondi
Annealing: 62°C, 30 secondi 25 cicli Estensione: 72°C, 30 secondi
Estensione finale: 72°C, 5 minuti
Il profilo termico della seconda reazione ha previsto: Denaturazione: 95°C, 10 minuti
Denaturazione: 94°C, 30 secondi
Annealing: 62°C, 30 secondi 40 cicli Estensione: 72°C, 30 secondi
Estensione finale: 72°C, 5 minuti
3) Elettroforesi in gel di agarosio e lettura dei risultati. Per la valutazione di sensibilità e specificità delle diverse reazioni sono state eseguite le relative prove.
Prove di sensibilità
Al fine di valutare la concentrazione minima di spore rilevabili attraverso la reazione di amplificazione del DNA, sono state effettuate cinque diluizioni seriali in base 10 ottenute partendo da una soluzione di spore di E. cuniculi con concentrazione 106-107 spore/ml.
Prove di specificità
Non è stato possibile valutare possibili amplificazioni non specifiche di altre specie di microsporidi, in quanto non erano disponibili i relativi controlli positivi. Tuttavia, per testare la specificità degli amplificati, alcuni campioni positivi
scelti casualmente sono stati sottoposti a sequenziamento genomico. Un’ulteriore prova di specificità è stata effettuata per escludere la possibilità delle coppie di primers selezionate di amplificare DNA di coniglio.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Le reazioni di PCR 1 e 2 non sono risultate in grado di amplificare DNA specifico di E. cuniculi. Infatti, tali reazioni, eseguite in seguito alla fase di estrazione del materiale genetico effettuata sulla soluzione di controllo positivo, non hanno dimostrato l’amplificazione dei frammenti di DNA di dimensione attesa. Il risultato può essere spiegato valutando che in entrambi i lavori considerati le spore di E. cuniculi erano coltivate e isolate su linee cellulari di rene di coniglio prima di essere testate mediante PCR. Pertanto, risulta evidente come la sensibilità considerata adeguata per campioni caratterizzati da una concentrazione elevata di spore risulti insufficiente nel rilevare le concentrazioni particolarmente esigue che si riscontrano in reni di animali naturalmente infetti da encefalitozoonosi (1).
La reazione 3 si è dimostrata in grado di amplificare DNA di interesse dall’estratto della soluzione di controllo contenente spore di E. cuniculi, ma non dal tessuto renale. Le prove di specificità hanno rivelato la capacità dei primers utilizzati di legarsi a porzioni di materiale genetico conservato di coniglio che, essendo presente nel tessuto renale in concentrazione nettamente superiore a quello del parassita, comportava il consumo dei reagenti disponibili.
La reazione di PCR booster (reazione 4) è risultata in grado di amplificare materiale genetico specifico da reni di coniglio naturalmente infetti. Gli amplificati dei campioni positivi sottoposti a sequenziamento genomico hanno evidenziato la presenza di materiale genetico riferibile alla specie E. cuniculi con un’omologia del 99%, dimostrando l’elevata specificità della metodica. Le diluizioni della soluzione di controllo effettuate, hanno permesso di stimare la sensibilità della metodica intorno a 103–104 spore/ml (Figura 1).
Figura 1: prova di sensibilità della Reazione 4 Lane1: marker; lane 2: bianco estrazione; lane3: bianco PCR; lane 4: diluizione -6; lane 5: diluizione -5; lane 6: diluizione -4; lane 7: diluizione -3; lane 8: diluizione -2; lane 9: diluizione -1; lane 10: intero; lane 11: bianco PCR. In relazione ai risultati ottenuti nel corso delle prove eseguite per la messa a punto di una metodica sensibile e specifica è quindi stata confermata la validità diagnostica solamente della reazione 4. Tuttavia, considerando la concentrazione di spore particolarmente ridotta presente nel tessuto renale di animali infetti, la sensibilità della reazione messa a punto può essere considerata discreta e sarebbe auspicabile
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eseguire ulteriori prove per incrementarla. Il nostro tentativo di aumentare la sensibilità inserendo ulteriori cicli di reazione è risultato inefficace in quanto causava l’amplificazione di frammenti aspecifici e la formazione di bande inattese. BIBLIOGRAFIA
1. Csokai J., Joachim A., Gruber A., Tichy A., Pakozdy A., Kunzel F., (2009). Diagnostic markers for encephalitozoonosis in pet rabbits. Veterinary Parasitology, 163, p: 18-26.
2. Gibelli L., Lavazza A., Tittarelli C., Rota Nodari S., Nassuato C., Gelmetti D. (2011). Proceedings of the Congr. Naz. ASIC, Forlì, Italy, 8-9 Aprile 2011.
3. Giordano C., Weigt A., Vercelli A., Rondena M., Grilli G., Giudice C, (2005). Immunohistochemical identification of Encephalitozoon cuniculi in Phaoclastic uveitis in four rabbits. Veterinary Ophtalmology, 4 (8), p: 271-275.
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5. Militerno G., Morandi F., Toffetani L., Trevisani M., Marcato P. S., (2006). Encefalitozoonosi (E. cuniculi) in conigli macellati della Romagna e del Veneto: quadri anatomoistopatologici ed ultra strutturali. Atti III Congresso nazionale AIPvet, Pisa, 11-13 Maggio 2006.
6. Rossi P., La Rosa G., Ludovisi A., Tamburini A., Gomez Morales M. A., Pozio E., (1998). Identification of a human isolate of Encephalitozoon cuniculi type I from Italy. International Journal of Parasitology, 28 (9), p: 1361-1366. 7. Valencakova A., Balent P., Novotny F., Cislakova L., (2005). Application of a specific primers in the diagnosis of Encephalitozoon spp. Ann. Agric. Environ. Med., 12, p: 321- 323.