De Giuseppe A., Casciari C., Ferrante G., Bazzucchi M., Forti K., Torresi C., Rizzo G., Feliziani F.
(1)Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche
Key words: BLV, ricombinante, chimera
SUMMARY
Bovine leukemia virus (BLV) is a retrovirus that induces a chronic infection in cattle. Eradication and control of the disease is based on early diagnostic and segregation of the seropositive animals.
An Elisa test was developed: it was based on a Chimeric recombinant antigen containing the expression of the two major immunogenic protein of the BLV respectively named gp51 and p24. The CHIMERA ELISA revealed high values of sensitivity and specificity and, therefore, can be effectively used for the diagnosis of Enzootic Bovine Leucosis.
INTRODUZIONE
La Leucosi Bovina Enzootica (LEB) è una malattia contagiosa che colpisce i bovini dando luogo ad una neoplasia maligna letale a distribuzione organica sistemica. L’agente eziologico appartiene alla famiglia delle Retroviridae che raccoglie virus in grado di causare forme tumorali nei mammiferi, negli uccelli e nei rettili. In questa famiglia è compreso anche il virus della human T-cell leukemia molto simile al quello della LEB. Il virus della LEB (BLV) può determinare, dopo un lungo periodo di incubazione, un linfosarcoma. La risposta anticorpale umorale indotta dal virus non blocca la sua replicazione nell’ospite.
Dal 1996 la LEB è oggetto di un piano nazionale di eradicazione basato sul controllo sierologico individuale dei bovini di età superiore a 12 mesi e sulla macellazione dei capi risultati sieropositivi.
Le norme nazionali che regolano il Piano di eradicazione della Leucosi Bovina Enzootica e gli scambi intracomunitari (DM 2/05/1996 n°358 e DL del 22/05/1999 n°196) contengono alcuni allegati tecnici in cui sono dettagliatamente descritte le prove diagnostiche da utilizzare nell’applicazione del piano: l’immunodiffusione in gel di agar (AGID) e l’ELISA. La tecnica AGID è la prova “storica” su cui sono stati basati i piani di profilassi in Italia, ma recentemente il test maggiormente utilizzato è quello immunoenzimatico. Il Centro di Referenza Nazionale per lo studio dei Retrovirus correlati alle patologie infettive dei Ruminanti (CEREL) ha già da tempo messo a punto un kit ELISA home made basato su un antigene ricombinante che ha dato prova di ottime perfomance diagnostiche.
Questo test è usato nella routine dei laboratori di sierologia afferenti all’Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche nell’applicazione dei piani di sorveglianza per LEB, ma è anche validamente usato da parte del CEREL per scopi di ricerca o per confermare risultati di prima istanza espressi da altri laboratori nel territorio nazionale. La mancanza di un Gold Standard inoltre, richiede un’attenta valutazione dei casi dubbi che possono essere definitivamente valutati solo attraverso l’impiego di diverse prove diagnostiche.
Da tempo il CEREL ha adottato la procedura di testare i
campioni di difficile interpretazione con diverse metodiche ivi comprese quelle di tipo biomolecolare (PCR tradizionale, Real Time…), ma questo non sempre è possibile, sia perché queste tecniche a loro volta non garantiscono un’assoluta veridicità del risultato, sia perché talvolta il volume dei campioni o il loro stato di conservazione non consente di effettuare più test.
Da tutti questi motivi nasce l’esigenza di avere disponibile un test affidabile in termini di sensibilità, ma che possa anche garantire un livello di specificità tale da aiutare la valutazione diagnostica. Questo obiettivo verosimilmente può essere raggiunto impiegando antigeni e reagenti diversi da quelli che costituiscono i kit disponibili in commercio. I riferimenti legislativi internazionali come anche i trattati riguardanti la standardizzazione delle tecniche ELISA (es. Manuale OIE) fanno riferimento essenzialmente alla proteina gp51 del BLV come antigene su cui devono essere basati i kit da impiegare nella diagnosi indiretta di BLV. D’altro canto il virus esprime anche altre proteine fortemente immunogene in grado di essere adeguatamente rilevate come ad esempio la proteina p24 che in diversi lavori scientifici è stata utilizzata come base per test immunoenzimatici.
Si è quindi pensato di associare queste due proteine in un unico test ELISA basato su un antigene costruito sinteticamente in modo da esprimere le qualità immunogene della gp51 e della p24 per mantenere la sensibilità al livello già ottimale degli altri test ELISA ed avere maggiori garanzie da un punto di vista della specificità.
MATERIALI E METODI
Costruzione dei baculovirus ricombinanti: Tutti i primers impiegati sono stati designati in base alla sequenza nucleotidica del genoma del BLV riportata in letteratura (1) L’amplificazione del gene codificante la p24 del virus BLV è stata eseguita mediante l’impiego dei primers p24NN/F (5’-GCTAGCGCCGGCCCAATCTCTGAAGGGAATC-3’) p24NN/R(5’-GCTAGCGCCGGCGAGAAGTGCAGGCTGTT TC-3’), che includono entrambi i siti di restrizione NgoMIV e NheI. L’amplicone ottenuto è stato clonato nel vettore procariotico pCR Blunt Vector (Invitrogen) generando così il plasmide pCR p24.
Il gene codificante per la gp51 è stato recuperato dal plasmide pB4gp51 dopo digestione con gli enzimi di restrizione XhoI e HindIII e purificato. I primers OplE2 forward e reverse (Invitrogen) sono stati usati per amplificare il doppio tag V5-6xHis dal vettore pIZT/V5His (Invitrogen). La sequenza nucleotidica amplificata è stata clonata nel vettore pCR 2.1 e sequenziata. Il frammento Xho I - HindIII e l’inserto V5-His6, recuperato dal vettore pCR 2.1 a seguito della digestione con gli enzimi HindIII e NsiI, sono stati clonati nel vettore pFastBac 1 (Invitrogen) tagliato con le endonucleasi SalI e PstI, generando il plasmide pFB1gp51/V5-His.
parte C-terminale e il corrispettivo costrutto ∆175-268gp51- STH/pFB1 è stato ottenuto come riportato in precedenza (2). Per la costruzione del baculovirus transfer vector contenente la sequenza nucleotidica codificante per la proteina chimerica gp51/p24, l’inserto NgoMIV, derivante dalla digestione con l’omonimo enzima del plasmide pCRp24, è stato clonato nel costrutto pFB1gp51/V5-His digerito con l’endonucleasi di restrizione AgeI. L’esatto orientamento del clonaggio del gene p24 è stato poi verificato per mappa di restrizione. Allo stesso modo, il baculovirus transfer vector contenente l’informazione genetica relativa alla proteina chimerica ∆175-268gp51/p24-STH, e stato ottenuto clonando l’inserto p24, derivante dal plasmide pCRp24 digerito con l’enzima NheI, nel costrutto pFB1gp51/V5-His digerito con lo stesso enzima.
Western Blotting: Aliquote di terreno colturale contenente le proteine chimeriche gp51/p24 e ∆175-268gp51/p24-STH, sono stati sottoposte a SDS-PAGE ed immunoblotting. Le proteine sono state denaturate a 95°C per 5 min in presenza di buffer 4x NuPage (Invitrogen) e DDT 100 mM e sottoposte ad elettroforesi su gel Bis-Tris precasting NuPage al 10% in presenza del buffer MOPS. A seguito del trasferimento su membrane di PVDF, le stesse sono state incubate over night con un anticorpo monoclonale (Mab) anti-gp51 in grado di interagire con un epitopo lineare della gp51 ed un altro Mab specifico per la p24. La visualizzazione delle bande specifiche è stata effettuata in chemioluminescenza attraverso l’impiego di un Mab anti-mouse coniugato a perossidasi ed il reagente SuperSignal West Pico Chemiluminescence Substrate (Pierce Biotechnology). ELISA test: La reattività delle proteine oggetto di studio verso i sieri derivanti da bovini infetti con il BLV, è stata valutata mediante analisi immunoenzimatica attraverso l’impiego di un kit ELISA home made messo a punto nei nostri laboratori (3). Inoltre, le caratteristiche antigeniche delle chimere sono state ulteriormente saggiate impiegando un anticorpo monoclonale (Mab) diretto verso l’epitopo conformazionale G della gp51. In questo caso, il Mab 2G7 impiegato nel kit home made è stato sostituito dal mab anti-G.
Produzione delle proteine chimeriche: Cellule d’insetto Sf21 sono state transfettate con il DNA bacmidico ricombinante impiegando il reagente Cell-fectin reagent (Invitrogen). Dopo 5 giorni di incubazione a 27 °C, il sovranatante è stato raccolto (P1 viral stock) ed impiegato per infettare 2 x 106 cellule Sf21 seminate in fiasca da 25 cm2 in 5ml di terreno HYQ SFX-Insect serum-free medium (Hyclone), al fine di ottenere uno stock di virus ricombinanti ad elevato titolo (P2 viral stock). Tre ml di P2 viral stock sono stati poi utilizzati per infettare 300 ml di coltura di SF21 (a concentrazione pari a 1.8 x 106 cellule/ml) cresciute in sospensione su bottiglie rotanti (P3 viral stock). Per la produzione degli antigeni ricombinanti le cellule Sf21 sono state cresciute su bottiglie rotanti (Corning Life Sciences) in presenza del terreno contenente 100 µg/ml di streptomicina, 0.25 µg/ ml di anfotericina B, 100 UI/ml penicillina e 10 µg/ml di gentamicina. La sintesi delle proteine chimeriche su media scala, è stata eseguite mediante infezione con i vari P3 viral stock delle Sf21 seminate a 2 x 106 cellule/ml in 100 ml totali. I virus sono stati inoculati in quantità tale da avere molteplicità di infezione (MOI) nel range 0.1-1 particelle virali/cellula. Tre giorni dopo l’infezione, i terreni colturali contenenti le proteine ricombinanti, sono stati raccolti, centrifugati a 5,000 x g per 10 minuti e congelati a -20°C.
RISULTATI
Gli antigeni sintetici prodotti sono stati sottoposti ad indagini sierologiche impiegando, come confronto, un kit ELISA home made specifico per la gp51 del virus BLV ottenendo un’apprezzabile identicità di risultati.
Maggiori informazioni sperimentali sono emerse dall’applicazione di un successivo test ELISA: il Mab 2G7 (in grado di legare un epitopo lineare della gp51), impiegato come catcher, è stato sostituito da un Mab anti-G (capace di reagire con un epitopo conformazionale della stessa proteina) confermando i risultati precedentemente ottenuti. L’indagine sierologica da sola non poteva fornire informazioni sulla corretta fusione tra la gp51 e la p24 né evidenziare eventuali variazioni della struttura della p24 come conseguenza della stessa fusione. Per questo motivo, le caratteristiche strutturali ed antigeniche delle proteine chimeriche sono state analizzate e valutate anche in Western blotting mediante l’impiego di due Mab specifici, uno per la gp51 (Mab 2G7) e l’altro per la p24. Entrambi gli anticorpi hanno rivelato la presenza di due proteine identiche con un peso molecolare rispettivamente di circa 80 kDa per la proteina di fusione gp51/p24 e approssimativamente di 60 kDa per la proteina Δ175-268gp51/p24-STH (Fig. 1.A e B). Inoltre, l’ottima reattività tra chimere ed il Mab anti-p24 ha fornito la prova che la fusione tra le due differenti proteine è avvenuta secondo le modalità attese.
Figura 1. Analisi in Western blot dei terreni colturali contenenti le proteine ricombinanti chimeriche mediante l’impiego del Mab 2G7(A) e di un Mab anti-p24 (B). r-gp51 (linea 1); proteina chimerica gp51/p24 (linea 2); proteina chimerica Δ175-268gp51/p24-STH (linea 3); proteina ricombinante p24 (linea 4).
DISCUSSIONE
Sulla base di precedenti acquisizioni scientifiche relative all’espressione delle proteine ricombinanti del virus BLV, per la costruzione di baculovirus ricombinanti sono state utilizzate due differenti forme della gp51 ( la forma integra e la forma deleta, rappresentata dai primi 174 amminoacidi) mentre per la p24 è stato impiegato l’intero gene (2). Condizione obbligata nella costruzione delle chimere, è stata quella di porre il gene della gp51 a monte rispetto a quella della p24. In effetti, essendo la prima una glicoproteina necessita della sua Signal Sequence (rappresentata dai primi 33 amminoacidi) per la glicosilazione degli omonimi putativi siti aventi consensus ammino-acidico NXT/S. Comunque, non
avendo conoscenze in merito alla produzione di proteine derivanti dalla fusione di questi due antigeni si è preferito, in un primo tempo, realizzare una chimera costituita dai due geni sintetizzanti le proteine in forma integra al fine di preservare, almeno su base teorica, le caratteristiche antigeniche. Di seguito l’impiego della forma deleta della gp51, costruita ed espressa precedentemente nei nostri laboratori, ha permesso di ottenere una chimera in cui sono presenti nella sua parte C-terminale due tag (lo Strep-tag e la poli-Istidina) impiegabili per un’eventuale e/o necessaria purificazione della stessa. Entrambe le proteine chimeriche sono state espresse a livelli quali-quantitativi ottimali dove, almeno come risulta dai primi approcci sperimentali, entrambe hanno manifestato un identico grado di funzionalità.
Bibliografia
1. N. Sagata, T. Yasunaga, J. Tsuzuku-Kawamura, K. Ohishi, Y. Ogawa, Y. Ikawa. Complete nucleotide sequence of the genome og bovine leukaemia virus: Its evolutionary relationship to other retroviruses, Prot. Natl. Acad. Sci. 82 (1985) 677-681.
2. Antonio De Giuseppe, Katia Forti, Francesco Feliziani, Giulio Severi, Monica Cagiola. Purification by Strep-Tactin affinity chromatography of a delete envelope gp51 protein of Bovine Leukaemia Virus expressed in Sf21 insect cells Protein Journal (2010) 29: 153-160.
3. A. De Giuseppe, F. Feliziani, D. Rutili, G.M. De Mia, Expression of Bovine Leukemia virus envelope glycoprotein (gp51) by recombinant baculovirus and its use in an ELISA test. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 11 (2004) 147-151.