IN BOVINI INFETTI DA Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: DATI PRELIMINARI
Mazzone P.1, Vitale N.2, Ricchi M.3, Corneli S. 1, Mangili P. M.1, Papa P. 1, Caporali A.1, Biagetti M.1,Checcarelli S.1, Ciullo M.1, Gradi M.1, Guglielmi F. 1, Fumanti P.1,Benedetti F.1, Raber A.4, Arrigoni N. 3 e Cagiola M.1
1Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche 2Istituto Zooprofilattico Sperimentale Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
3Centro di Referenza Nazionale per la Paratubercolosi - Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia ed Emilia Romagna 4Prionics AG Switzerland
Key words: paratubercolosi bovina, γ-IFN test, M. avium subsp. paratuberculosis
SUMMARY
The main mycobacterial diseases affecting cattle are bovine Tuberculosis (bTB), due to Mycobacterium bovis and bovine Paratuberculosis (PTBC), caused by M. avium subsp. paratuberculosis (MAP). Ante-mortem diagnosis of bTB relies on tests that measure the cell-mediated response (skin test and gamma interferon test). Unfortunately, the performance of these tests may be significantly affected by previous exposure to MAP. The diagnosis of PTBC is usually based on serology and faecal culture, which detect advanced stages of infections. The development of an immunological test that, at the same time, can distinguish between animals infected with M.bovis or MAP and enables an early diagnosis of PTBC, could support the control of both diseases. To improve the analytic performances of γ-IFN test, 3 purified protein derivatives (PPD) of MAP (Johnin) were produced, in order to stimulate lymphocytes, in association with the classic avian and bovine PPDs. In this preliminary study, our Johnin seems to be useful to highlight PTBC infected animals, avoiding false positive reaction for bTB.
INTRODUZIONE
Il test del γ-interferon (γ-IFN) in affiancamento alla prova intradermica (IDT), viene utilizzato in molti paesi europei nella diagnosi della Tubercolosi Bovina (bTB). Tale metodica rileva la quantità di citochina prodotta dai linfociti T degli animali infetti, in risposta ad una stimolazione effettuata con gli antigeni tubercolari (1). La valutazione immunologica per individuare animali infetti da Mycobacterium bovis (MB) risulta spesso complicata da reazioni crociate che si osservano negli animali esposti ad altre specie di micobatteri, in particolare Mycobacterium avium subsp. avium (MAA) e Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) agente responsabile della Paratubercolosi bovina (PTBC). Gli antigeni normalmente impiegati nella fase di stimolazione dei linfociti prevista nel γ-IFN test sono le tradizionali tubercoline bovina e aviare, derivati proteici purificati estratti rispettivamente da MB (PPDB) e da MA (PPDA). La Johnina (PPDJ), analogamente alle tubercoline, è un derivato proteico purificato ottenuto da una coltura in terreno liquido sintetico di MAP, mediante precipitazione con acido tricloroacetico (TCA), lavaggio del precipitato e sua dissoluzione in tampone fosfato fenolato e glicerina in opportuna concentrazione (2).
Nel presente studio sono state prodotte e valutate tre diverse Johnine sperimentali (PPDJ) ottenute da colture di 2 ceppi di MAP di campo ed il ceppo MAP ATCC 19698. Le tre PPDJ sperimentali sono state utilizzate, in affiancamento alle PPDB e PPDA, nella fase di stimolazione linfocitaria del test γ-IFN, per verificare l’efficacia del loro impiego nell’evidenziare correttamente l’infezione paratubercolare senza rilevare false positività alla bTB.
MATERIALI E METODI
Sono stati utilizzati nella sperimentazione 24 animali provenienti da 3 allevamenti di bovine da latte, risultati Ufficialmente Indenni (UI) da bTB negli ultimi 6 anni. In tutti gli allevamenti selezionati, nell’ultimo anno, sono stati riscontrati
casi clinici di PTBC, confermati da indagini sierologiche e accertamenti post-mortem. Gli animali sono stati sottoposti in parallelo a:
• Test ELISA per PTBC “ID Screen® paratuberculosis Indiretto” (IDVet Innovative Diagnostics, Montpellier- France) da siero di sangue.
• PCR per la ricerca diretta di MAP dalle feci. L’estrazione è stata eseguita disciogliendo 1 g di feci in 25 ml di acqua, dopo decantazione per 30 min, sono stati prelevati dal fondo 250 µl a cui è stato aggiunto 1 ml di ASL buffer (Qiagen buffer ASL stool lysis buffer). Dopo omogeneizzazione in Ribolyzer, il DNA è stato estratto da 200 µl di omogenato mediante kit commerciale (DNA mini kit blood and body fluid Qiagen). L’amplificazione è stata effettuata con una Nested PCR (3).
Sono stati considerati positivi per PTBC i soggetti in cui è stato evidenziato esito positivo in almeno uno dei due test (ELISA e/o PCR).
Allestimento Johnine: Presso il Centro di Referenza Nazionale per la PTBC, 20 ceppi di campo di MAP, candidati ad essere utilizzati per la produzione dei lotti di PPDJ, sono stati genotipizzati mediante amplificazione di loci minisatelliti e micro satelliti (4). Sono stati selezionati 2 ceppi di campo: ceppo A che presenta il profilo genetico più frequente in Italia; ceppo B che invece rappresenta un profilo genetico raro nel territorio nazionale. Nella fase di allestimento della PPDJ, oltre ai ceppi A e B, è stato utilizzato il ceppo ATCC 19698. I tre ceppi di MAP sono stati coltivati in terreno liquido Watson-Reid (WR) modificato, per 60 giorni a 37°C per ottenere la coltura primaria. I passaggi successivi delle colture sono stati effettuati in bottiglie Roux contenenti 500 ml di WR modificato, incubate per 4 mesi a 37°C. L’estratto proteico è stato ottenuto utilizzando il protocollo in uso presso l’IZSUM per la produzione delle PPD Bovina e Aviare (D.M. 26 giugno 1981). Il valore in azoto proteico delle PPDJ sperimentali è stato determinato con metodo Kjeldahl (proteine = 6 • 25 x N). Il titolo finale è stato portato a 1 mg / ml mediante l’aggiunta di un diluente contenente 10% di glicerina, 0,5% di fenolo e 0,5 di NaCl in tampone fosfato M/30.
Stimolazione in vitro e Test ELISA per γ-IFN: I campioni di sangue eparinizzato dei 24 soggetti, sono stati dispensati in aliquote da 1 ml in piastre per colture cellulari e stimolati rispettivamente con:
• “Phosphate Buffered Saline” (PBS 0,01 M, pH 7,2); • 30 μg di PPDB e 30 μg di PPDA Australiane (di seguito
indicate come AA e BA) (AgriQuality Australia Pty Ltd, Victoria, Australia);
• 10 μg di PPDB e 10 μg di PPDA Italiane (di seguito indicate come AI e BI) prodotte presso l’IZSUM;
• Le tre PPDJ (Ceppi A, B, C) con tre diverse diluizioni (1:5, 1:10 e 1:15).
Dopo 24 ore di incubazione, si è proceduto alla raccolta del plasma e la successiva valutazione del γ-IFN è stata eseguita con kit Elisa “M.bovis Gamma Interferon test Kit for Cattle” (BOVIGAM®). I valori ottenuti, espressi in unità di densità ottica (OD) rilevata a 450 nm, sono stati interpretati considerando come positivi valori di OD ≥ al doppio dell’OD riscontrata nei pozzetti con solo PBS (2N), secondo lo schema interpretativo in uso presso l’IZSUM (5). Sono state calcolate quindi le differenze tra le OD dei campioni e il rispettivo valore di 2N.
Per valutare il “fattore diluizione” delle Johnine (1:5, 1:10; 1:15) e il “fattore ceppo” (A,B,C) è stata condotta un’analisi della varianza a 2 vie utilizzando la procedura Proc GLM del software SAS® v9.2.
Il confronto tra le medie delle differenze tra la stimolazione con PPDJ ceppo A, B, C e la stimolazione con PPDB Australiane e PPDB Italiane è stato valutato tramite il Test del range di Student di Tukey (HSD) per valori di p ≤ 0,02. La specificità relativa delle PPDB e delle PPDJ nella diagnosi di bTB (allevamenti UI da bTB) è stata calcolata utilizzando come Gold Standard l’IDT.
La sensibilità relativa delle sole PPDJ nella diagnosi di PTBC (allevamenti infetti da MAP) è stata calcolata utilizzando come Gold Standard la positività in ELISA e/o PCR.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Dei 24 animali indenni da bTB (negativi all’IDT e provenienti da allevamenti UI), 16 sono risultati positivi ad almeno uno dei due test per MAP (ELISA e/o PCR da feci) e 8 sono risultati negativi ad entrambi. I risultati della stimolazione linfocitaria con le diverse PPD e le PPDJ, nei 16 soggetti positivi per PTBC, sono mostrati in Figura 1.
Figura 1: Produzione di γ-IFN nei linfociti stimolati con le diverse PPD e con le tre PPDJ in animali positivi per PTBC (ELISA e/o PCR). I valori sono espressi come Media delle differenze tra l’OD450 e il doppio dell’OD450 riscontrata
con solo PBS ± Deviazione Standard. AA: PPD Aviare Australiana; BA: PPD Bovina Australiana; AI: PPD Aviare Italiana; BI: PPD Bovina Italiana; JA, JB, JC: Johnine sperimentali allestite rispettivamente con i ceppi di MAP A (ceppo prevalente), B (ceppo raro), C (ATCC)
I risultati dell’analisi della varianza hanno evidenziato una differenza statisticamente significativa tra le medie OD450 delle PPDJ sia per il “fattore diluizione” delle Johnine (test F =28.44; p<0.0001), che per il “fattore ceppo” (test F =9.82; p<0.0001). Per quanto riguarda le diluizioni i dati osservati mostrano che la diluizione 1:5 stimola la maggiore produzione di γ-IFN (valore medio di OD450 maggiore) per tutte e tre le PPDJ e la differenza è statisticamente significativa. Per quanto riguarda il fattore ceppo, il ceppo B è quello meno potente tra i tre mentre non ci sono differenze statisticamente significative tra ceppo A e ceppo C.
Per quanto riguarda la diagnosi di bTB, lo schema interpretativo utilizzato per evidenziare eventuali reattività per MB (5), prevede l’utilizzo comparativo di PPDA e PPDJ nei confronti di PPDB. I risultati della specificità per bTB sul campione di 24 capi UI da bTB (IDT negativa) mostrano una specificità pari a 100% (IC95: 85-100%) sia prendendo in considerazione le PPDA italiane che le PPDJ sperimentali.
I risultati della sensibilità relativa nella diagnosi di PTBC, delle PPDA Australiane e Italiane e delle PPDJ sono riportati in tabella 1. Le PPDJ ceppi A, B, C riescono a rilevare un elevato numero di soggetti infetti MAP con risultati sovrapponibili. I dati che emergono dalla sperimentazione, per quanto preliminari, sono perfettamente in linea con quanto evidenziato da altri autori, confermando l’elevata specificità delle PPDA (1,5) e delle Johnine (6) nel non rilevare false positività nei confronti della bTB.
Tabella 1: Valori di sensibilità relativa nella diagnosi di PTBC delle PPD Aviari e delle Johnine sperimentali ceppi A, B e C
PPD SE SE IC95% Aviare Australiana 69% 41-89% Aviare Italiana 69% 41-89% Johnina A (1:5) 69% 41-89% Johnina A (1:10) 63% 35-85% Johnina B (1:5) 75% 48-93% Johnina B (1:10) 63% 35-85% Johnina C (1:5) 69% 41-89% Johnina C (1:10) 63% 35-85%
La scarsa potenza della Johnina B potrebbe essere legata al basso potere immunogeno del MAP B, nei confronti del quale non esiste memoria immunologica nei soggetti infetti, dal momento che il ceppo è poco rappresentato in Italia. Per quanto riguarda la sensibilità delle PPDJ nell’evidenziare soggetti infetti da MAP, bisogna tener conto che come Gold Standard sono state utilizzate due prove (ELISA e PCR) che rilevano stadi avanzati della malattia. In realtà, poiché la PTBC è una malattia con un lungo periodo d’incubazione, e non è possibile, con le attuali metodiche, evidenziare uno stato precoce di infezione, sarebbe auspicabile nella seconda parte della sperimentazione monitorare gli 8 soggetti identificati come negativi da ELISA e PCR. In tal caso 3 di questi soggetti, considerati come positivi per PTBC dalle PPDJ nel γ-IFN, ma ad oggi ritenuti falsi positivi, potrebbero rivelarsi bovini recentemente infetti in cui le Johnine avevano evidenziato uno stadio precoce dell’infezione da MAP. Pertanto nel futuro il follow up sugli animali e il reclutamento di ulteriori soggetti, permetteranno di sviluppare uno studio longitudinale e di
valutare un possibile utilizzo delle PPDJ nel γ-IFN test per una diagnosi precoce di PTBC.
Sperimentazione realizzata grazie al finanziamento del Ministero della Salute nell’ambito del Progetto di Ricerca Corrente RC IZSUM 11/ 2008.
BIBLIOGRAFIA
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3. Millar D, Ford J, Sanderson J, Withey S, Tizard M, Doran T, Hermon-Taylor J. (1996) IS900 PCR to detect
Mycobacterium paratuberculosis in retail supplies of whole pasteurized cows’ milk in England and Wales. Appl Environ Microbiol. 62(9):3446-52.
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5. Mazzone P., Agnetti F., Biagetti M., Cagiola M., Mangili PM., Nardini R., Papa P., Scoccia E., Maresca C. (2010) Infezione da Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis e gamma-interferon test. Argomenti (Marzo): 44-47
6. Kalis C.H.J., Collins M.T., Hesselink J.W., Barkema H.W. (2003) Specificity of two tests for the early diagnosis of bovine paratuberculosis based on cell-mediated immunity: the Johnin skin test and the gamma interferon assay. Veterinary Microbiology 97: 73–86.
IFN-γ TEST PER LA DIAGNOSI DI TUBERCOLOSI BOVINA NEL SUINO NERO SICILIANO
Pesciaroli M. 1, Mazzone P.2, Marianelli C.1, Corneli S.2, Russo M.3, Aronica V.3, Fiasconaro M.3,Biagetti M. 2, Ciullo M. 2, Cagiola M.2, Pasquali P.1 e Di Marco V.3
1Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare 2Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche
3Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia
Key words: Mycobacterium bovis, pig, IFN-γ
SUMMARY
Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine tuberculosis (bTB) has a broad host range, that includes also pig. This study evaluated the performances of the IFN-γ assay in detecting M. bovis infected pigs and compared the data obtained with the presence of tuberculosis lesions and the findings of M. bovis in the microbial cultures. Our preliminary results demonstrate an excellent correspondence between the IFN-γ assay and both post mortem diagnostic approaches and indicates the IFN-γ assay as an useful tool for intra vitam diagnosis of pig tuberculosis.
INTRODUZIONE
Mycobacterium bovis appartiene al gruppo del Mycobacterium tuberculosis complex (MtbC). La peculiarità che lo distingue dagli altri membri di questo gruppo è la capacità di poter infettare una gamma eccezionalmente ampia di animali che comprende specie domestiche, animali selvatici e d’allevamento, come pure gli esseri umani (1). Questa spiccata capacità di adattamento è il fattore principale che rende complessa la situazione epidemiologica della tubercolosi bovina (bTB). Le diverse specie animali sensibili possono rappresentare un vero e proprio “reservoir” dell’infezione oppure semplicemente uno “spillover host” (ospite a fondo cieco). Tra le specie animali recettive al M. bovis vi è il maiale che fino a qualche anno fa era considerato solamente uno spillover host (1). La maggior parte dei casi di tubercolosi nei suini è attribuibile al Mycobacterium avium, di conseguenza le caratteristiche dell’infezione da M. bovis nei suini rimane ancora argomento d’indagine. Nei paesi industrializzati i piani di eradicazione e controllo della bTB si basano principalmente sulla macellazione e l’eliminazione dei bovini individuati come sospetti infetti sulla base dell’esito delle prove in vivo intradermoreazione (IDT) e saggio del γ-interferone (IFN-γ) (2). Le procedure diagnostiche utilizzate per individuare bovini infetti sono state adottate anche in altre specie animali (3), ma le informazioni circa l’uso di questi approcci diagnostici nei suini sono estremamente limitate. Nelle zone in cui M. bovis risulta ancora presente negli allevamenti bovini e il bestiame condivide il pascolo con la popolazione suina, il ruolo marginale che finora è stato attribuito al maiale nel mantenimento dell’infezione da M. bovis viene fortemente messo in discussione. In un contesto di questo tipo, infatti, è stato evidenziato che i maiali possono presentare elevate percentuali d’infezione da M. bovis e probabilmente rappresentarne anche un vero e proprio “reservoir” (4, 5). Lo scopo di questo studio è stato valutare l’adattabilità del IFN-γ test per la rilevazione di suini infetti da M. bovis e confrontarne i risultati con i tradizionali metodi diagnostici post-mortem: l’esame anatomo-patologico (EAP) e la coltura
batterica. Questa prima sperimentazione vuole essere la base per futuri studi volti a dimostrare la validità del saggio IFN-γ come strumento per la sorveglianza di infezione da M. bovis nella popolazione suina.
MATERIALI E METODI
Sviluppo del protocollo e delle curve dose risposta del IFN-γ: Per mettere a punto la metodica da utilizzare nella sperimentazione, campioni di sangue in toto di 15 suini sani sono stati stimolati con 5μl/ml di PWN e/o di PBS. Dopo 24 ore di incubazione a 37 °C al 5% di CO2 il supernatante è stato raccolto ed è stata valutata la produzione da parte dei linfociti di IFN-γ usando una sandwich ELISA (Porcine IFN- gamma Quantikine ELISA Kit, R&D Systems, Mn, USA). La stimolazione con PBS non ha indotto alcuna produzione di IFN-γ, al contrario, i campioni di sangue stimolati con PWN, hanno mostrato una produzione media di IFN-γ di 2633 µg/ ml con una deviazione standard di 688,2 µg/ml. Questi dati ci hanno portato a considerare inadeguati e di conseguenza a escludere, i campioni che, stimolati con PWN, non hanno risposto al mitogeno, presentando un OD inferiore all’OD standard contenente 1250 µg/ml (media - 2 DS) (dati non riportati).
Animali: 100 Suini Neri Siciliani, provenienti da allevamenti con pregresse positività per bTB (4), di età compresa tra i 12-24 mesi, sono stati coinvolti nello studio dopo campionamento casuale presso il mattatoio di Mirto (ME). Il Suino Nero Siciliano è una razza locale che vive nel Parco dei Nebrodi all’interno del quale pascolano bovini provenienti da allevamenti con prevalenze di bTB che vanno dall’8.58% al 5.36% (dati 2010 Ministero della Salute).
IFN-γ test: Un campione di sangue eparinizzato (10 ml) è stato prelevato dai maiali presso il mattatoio e inviato entro 8-10 ore al laboratorio della Sezione di Barcellona dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia (IZSSI). Ogni campione è stato dispensato in aliquote da 1,5 ml in piastre da 24 pozzetti (Costar, Corning Incorporated, Corning, NY, USA).
I campioni di sangue dei 100 suini inclusi nella sperimentazione, sono stati stimolati in doppio con:
• “Phosphate Buffered Saline” (PBS 0,01 M, pH 7,2), per la valutazione del valore basale di IFN-γ; • il mitogeno (Pokeweed mitogen) (PWN) (5μl/ml)
(Sigma-Aldrich, Ms, USA); • PPD bovina (10μg/ml) • PPD aviare (10μg/ml).
Le PPD impiegate sono state entrambe prodotte dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche (IZSUM), secondo i protocolli previsti dal D. M. 26 giugno 1981. I campioni di sangue sono stati incubati a 37°C
in atmosfera modificata (5% CO2) per 18-24 h. Dopo l’incubazione, ciascun campione è stato centrifugato a 500 g per 10 minuti a temperatura ambiente, il plasma è stato raccolto e stoccato a -20 °C fino al momento del test ELISA sandwich (Porcine IFN-gamma Quantikine ELISA Kit, R&D Systems, Mn, USA).
Schema interpretativo I valori ottenuti per ogni campione, espressi in unità di densità ottica (OD) rilevata a 450 nm, sono stati interpretati come segue:
a) Campione Negativo: il valore di OD dei campioni stimolati con PPD aviaria (AOD) e PPD bovina (BOD) era inferiore al doppio del valore di OD ottenuto per la stimolazione con PBS (2NOD);
b) Campione Positivo per M. bovis: il valore di OD del campione stimolato con PPD Bovina (BOD) era maggiore o uguale a 2NOD e il valore di OD del campione stimolato con PPD Aviare (AOD) era inferiore a 2NOD o quando BOD e AOD erano entrambi superiori a 2NOD e il rapporto BOD/AOD era ≥1,1;
c) Campione Positivo per M. avium: il valore di OD del campione stimolato con PPD Aviare (AOD) era maggiore o uguale a 2NOD e il valore di OD del campione stimolato con PPD Bovina (BOD) era inferiore a 2NOD o quando AOD e BOD erano entrambi superiori a 2NOD e il rapporto BOD/AOD era ≤ 0,9;
d) Campione Dubbio: i valori BOD e AOD erano entrambi superiori a 2NOD e il rapporto BOD/AOD era compreso tra 0,9 e 1,1.
Esame anatomo-patologico (EAP): è stato condotto secondo le tradizionali metodiche ispettive presso il Mattatoio di Mirto dove si procedeva al campionamento dei singoli apparati linfonodali.
Esame colturale: Presso l’IZSUM su ogni campione pervenuto è stato effettuato l’esame colturale per l’isolamento di micobatteri, eseguito secondo le metodiche tradizionali previste dal D.M. 592/95, su terreni solidi selettivi (Lowestein- Jensen e Stonebrink). Sulle colonie tipiche, risultate positive alla colorazione per acido resistenti, l’identificazione è stata eseguita mediante tecniche bio-molecolari (6, 7).
Risultati
Dei 100 maiali coinvolti nello studio, due soggetti non hanno reagito alla stimolazione con il mitogeno (PWM), per cui gli animali effettivamente presi in considerazione nella valutazione finale sono stati 98. I risultati sono mostrati in tabella 1. Dei 98 capi, 26 (26.5 %) sono risultati positivi al test del IFN-γ.
Il test del IFN-γ ha rilevato 22 dei 26 suini con lesioni simil- tubercolari (84.6% - IC95% 52.6-100%) e ha riconosciuto come sani 68 dei 72 animali privi di lesioni (94.4% - IC 95% 92.3-96.7%); ha riconosciuto come infetti 15 suini dei 19 con positività microbiologica (78.9% - IC95% 44.8-100%). Settantadue dei 79 suini risultati negativi alla diagnosi colturale hanno reagito negativamente anche al IFN-γ test (91.1%. 71.1-100%).
Come illustrato in tabella 1, gli esiti del IFN-γ test hanno concordato in misura maggiore con le lesioni rinvenute all’esame anatomo-patologico e in misura minore con i risultati dell’isolamento colturale di M. bovis a partire da campioni linfonodali.
Tabella 1: Confronto tra i risultati ottenuti nel test IFN-γ, i risultati dell’EAP e dell’esame microbiologico per la ricerca di M.bovis P: Positivo N: Negativo.
DISCUSSIONE
Per un lungo periodo si è creduto che le popolazioni di suini domestici e selvatici potessero avere un ruolo limitato nella diffusione della tubercolosi bovina; questa convinzione nasce dal fatto che i maiali erano considerati “spillover host” e che nella stragrande maggioranza dei contesti epidemiologici sono limitate le “sovrapposizioni” ecologiche tra bovini e suini (8). In scenari epidemiologici come quello siciliano, in cui il suino condivide habitat e pasture con popolazioni di bovini che presentano un’elevata prevalenza d’infezione da M. bovis, si può assistere facilmente alla circolazione di questo micobatterio anche nella popolazione suina. Il ruolo del maiale come ospite “a fondo cieco“ del M. bovis è messo in discussione. Tali condizioni rendono possibile ipotizzare l’implementazione in questa specie di strategie di controllo dell’infezione. Pertanto è sorta l’esigenza di sviluppare test