Goffredo E.1, Casoli L.1, Azzariti L.1, Castelluccio A.2, Carosielli L.2, Ramon E.3, Longo A.3, Dalla Pozza M. C.3
Enti: 1IZS Puglia e Basilicata, 2Azienda sanitaria Locale FG, 3IZS delle Venezie
Key words: Slaughterhouse, carcasses, Salmonella spp
INTRODUZIONE
Il Regolamento CE 2073/2005 (1) definisce i criteri di igiene, cui gli OSA, degli impianti di macellazione, devono far riferimento per la valutazione del processo produttivo. Tale valutazione si basa sul campionamento della superficie delle carcasse subito prima della refrigerazione per la valutazione di tre parametri microbiologici: Salmonella spp., CBT e Enterobatteriacee. Il veterinario ufficiale, qualora ritenga opportuno verificare il rispetto di tali criteri, può procedere ad ulteriori campionamenti. In tale ottica in un mattatoio privato di medie dimensioni che lavora principalmente suini ed ovini sono stati condotti campionamenti ufficiali da carcasse suine e ovine alla fine delle operazioni di macellazione, subito prima del raffreddamento, secondo le modalità previste dal Reg.(CE) 1441/2007 All.1 cap.3. A seguito di riscontro di Salmonella spp. su una carcassa suina, si è deciso di procedere a successivi campionamenti per ottenere dati più attendibili sulla reale situazione igienica del macello, valutando anche l’efficacia delle prescrizioni fatte per migliorare l’igiene del processo produttivo. Dopo il riscontro di Salmonella spp. sono stati effettuati anche tamponi da superfici di attrezzature sia della linea suina (vasca di scottatura, depilatrice, spazzolatrice, ganci) che della linea ovina (ganciera mobile, pareti sala iugulazione e sala eviscerazione) al fine di verificare se vi fosse persistenza di Salmonella spp. negli ambienti e sulle attrezzature e se questi potessero essere la fonte di contaminazione delle carcasse.
MATERIALI E METODI
Per un periodo di sette settimane, fra settembre e ottobre 2009, con frequenza settimanale, sono state campionate con il criterio della casualità 5 carcasse in una stessa seduta di macellazione, per la specie suina ed ovina. Su ciascuna carcassa venivano effettuati campionamenti da 4 punti di repere su una superficie di 100 cm2 per ciascun punto (ovini: collo - area retronucale, punta del petto, addome-grassella, torace laterale; suini: collo laterale, torace laterale, addome pancia, gamba laterale), utilizzando il metodo non distruttivo con spugna abrasiva preinumidita, secondo ISO 17604:2003. Le 4 spugne, riposte in un unico contenitore sterile venivano recapitate entro 1 ora dal prelievo, a 4°C, al laboratorio. Il campionamento da superfici ambientali veniva effettato dopo pulizia, disinfezione ed accurato lavaggio, su un’area di 100 cm2, utilizzando delimitatore sterile e spugne preinumidite con BPW. Nella stessa giornata del prelievo ciascun campione da carcassa, è stato sottoposto ad analisi per ricerca di Salmonella spp. utilizzando la ISO 6579:2002 e per le Enterobatteriacee (ISO 21528-2:2004). A ciascun campione aggregato venivano aggiunti 400 ml di terreno BPW; dopo stomatizzazione dalla sospensione madre venivano prelevati 2 ml utilizzati per la determinazione della carica di Enterobatteriacee, mentre la restante parte costituiva il prearricchimento per la ricerca di Salmonella spp.
La ricerca di Salmonella spp. sui tamponi ambientali è stata effettuata, sempre secondo la norma su citata, allestendo per ciascuna spugna un prearricchimento (100ml BPW/ spugna). In presenza di colonie sospette di Salmonella spp., per ciascuna carcassa, venivano prelevate 5 colonie (o tutte se presenti meno di 5 colonie) sottoposte successivamente ad identificazione biochimica. Gli isolati di Salmonella sono stati sierotipizzati secondo lo schema di Kauffman-White tramite agglutinazione a vetrino. Tutti i ceppi isolati sono stati inviati al CRN per le salmonellosi veterinarie-IZS delle Venezie per la tipizzazione fagica, eseguita seguendo lo schema interpretativo dell’International Federation for Enteric Phage Typing (HPA, Colindale, London) sui ceppi di S. Typhimurium e S. Enteritidis.Tutti gli isolati sonoo stati poi sottoposti a subtipizzazione molecolare tramite Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) secondo il protocollo PulseNet, previa digestione con XbaI. L’analisi dei cluster è stata eseguita utilizzando il software InfoQuest FP v. 4.5 (Bio-Rad, Hercules, CA).
RISULTATI
10 di 35 carcasse esaminate sono risultate positive per Salmonella spp. (28%). Tale risultato ha evidenziato una situazione per il macello al di fuori dai limiti di accettabilità previsti dal Regolamento 2073/2005. Gli isolamenti di Salmonella spp. sono stati ottenuti da 5 differenti partite di animali, 4 provenienti da uno stesso centro di raccolta olandese ed 1 direttamente da un allevamento sempre olandese, mentre 2 partite sono risultate negative. La carica di Enterobatteriacee, calcolata sugli stessi campioni ed espressa come valore logaritmico medio giornaliero per cm2, è sempre risultata inferiore al valore m (m =1,3 Log10 UFC/ cm2 media giornaliera, calcolato come indicato nelle Linee Guida Nazionali per l’applicazione del Reg CE 2073/2005 per il metodo non distruttivo). I campionamenti su 35 carcasse di ovini nelle stesse giornate di macellazione hanno portato all’isolamento di Salmonella spp. da 2 partite, entrambe provenienti da un centro di raccolta della Romania, mentre altre 4 partite, 1 in importazione dalla Romania e 3 dall’Ungheria sono risultate negative. Complessivamente sono risultate positive 6 carcasse (17%). Anche per le carcasse ovine la carica di Enterobatteriacee è risultata sempre inferiore al valore di m (0,8 Log10 UFC/ cm2 media giornaliera). In seguito ai risultati ottenuti, il veterinario ufficiale è intervenuto con prescrizioni già dopo il 1° campionamento disponendo una revisione del sistema HACCP che ponesse maggior attenzione alla pulizia e alla disinfezione dell’impianto e alla formazione del personale, ma soprattutto prescrivendo la pulizia e la disinfezione dei box delle stalle di sosta prima dell’introduzione di ogni nuova partita di bestiame. Inoltre è stata disposta la sospensione dell’attività dell’impianto nel fine settimana per procedere ad accurata pulizia e disinfezione dello stesso. Successivamente alla dinfezione sono state effettuate tre
serie di tamponi da superfici di aree ed apparecchiature di lavorazione delle linea di macellazione suina ed ovina, risultate sempre negative per Salmonella spp.
Lo studio degli isolati (Tab. 1 e 2) ha permesso di identificare fra i 34 ceppi da suini 5 sierotipi: 13 S. Typhimurium, 14 S. Brandemburg, 4 S. enterica subsp enterica 4,9,12:lv:- , 2 S. Havana, 1 S.Anatum. Nell’ambito dei ceppi di S. Typhimurium la fagotipizzazione ha permesso di classificare come appartenenti al fagotipo DT193 9 ceppi mentre, dei restanti 4, 1 apparteneva al fagotipo DT120 e 3 rientravano nel gruppo RDNC (lettura stabile non identificabile). Nell’ambito del fagotipo DT 193 si sono evidenziati 3 pulsotipi; 5 ceppi hanno presentato uno stesso pulsotipo e sono pertanto indistinguibili fra loro. I restanti 4 ceppi sono risultati appartenere a due pulsotipi con coefficiente di DICE del 90%, indice di una stretta correlazione, mentre rispetto ai restanti 5 si è evidenziata una scarsa similarità (coefficiente di DICE = 78%). In effetti questi 4 ceppi sono isolati da 3 carcasse suine macellate nello stesso giorno ed appartenenti ad una stessa partita. Invece dei restanti 5 ceppi di S.Typhimirium DT193 e identico pulsotipo, 4 erano stati isolati da 2 carcasse di una stessa partita macellate alla 5 settimana di controlli, mentre un quinto proveniva da una carcassa campionata nella prima settimana. L’analisi molecolare mediante PFGE dei restanti ceppi isolati da suini ha permesso di evidenziare per ciascun sierotipo un unico pulsotipo.
Va sottolineato che per 4 serie di campionamenti risultati positivi si è avuto isolamento di molteplici sierotipi e, per S. Typhimurium, di più fagotipi, non solo dalle carcasse macellate lo stesso giorno ed appartenenti ad una stessa partita, ma anche da una stessa carcassa.
Dagli ovini sono stati isolati 13 ceppi di Salmonella spp.: 2 da una stessa carcassa sono risultati alla sierotipizzazione S. Enteritidis e successivamente identificati come fagotipo DT13A con identico pulsotipo. I restanti 11, isolati da 5 carcasse macellate nella stessa giornata ed appartenenti ad una stessa partita sono risultati essere S. Typhimurium, appartenenti 6 al fagotipo DT8 e 5 al fagotipo DT30. Nell’ambito dei due fagotipi, isolati anche da una stessa carcassa, la subtipizzazione molecolare ha evidenziato totale identità dei ceppi (coefficiente DICE 100%).
CONCLUSIONI
La prevalenza di carcasse suine riscontrate positive (28%) è risultata molto più alta di quella attesa se si fa riferimento ai dati ottenuti nel corso del “Monitoraggio sulla prevalenza di Salmonella spp. nei suini al macello” (2) condotto nel 2006-2007 nei paesi della CE: i risultati di tale monitoraggio indicano una prevalenza, in base ai dati provenienti da 25 paesi membri del 10,3% su campioni di linfonodi mentre per i campioni da superficie prelevati da 13 paesi, fra cui non sono compresi né Italia né Olanda, la prevalenza è risultata ancora più bassa pari all’8,3%. Questo indica sicuramente l’esistenza di problemi specifici nell’ambito del macello oggetto di indagine. Circa gli isolamenti da carcasse ovine la prevalenza riscontrata è sicuramente inferiore a quella suina, ma comunque non trascurabile (17%). Pur non avendo dati di confronto, carenti sia a livello nazionale che europeo, i nostri risultati, avendo evidenziato sierotipi rilevanti (S. Typhimurium ed Enteritidis) suggeriscono indagini più approfondite sulla filiera ovina.
Tenuto conto che la carica di Enteobatteriacee è risultata sempre accettabile secondo i criteri stabiliti dal Reg
2073/2005 e che i tamponi ambientali prelevati a più riprese sono risultati sempre negativi, si deve ritenere che la contaminazione delle carcasse non sia ascrivibile a condizioni di igiene carente nel corso del processo di macellazione; si può piuttosto ipotizzare che l’isolamento di Salmonella spp. sia da ascrivere ad elevata contaminazione delle partite all’arrivo e/o a persistenza di Salmonella spp. nelle stalle di sosta, dove per altro si rispetta il criterio tutto vuoto- tutto pieno e dove, nel corso dell’indagine in base alle prescrizioni del veterinario ufficiale, si è posta maggiore attenzione alla disinfezione prima di ogni nuovo ingresso, senza notare miglioramenti. In effetti è noto (3) come le caratteristiche strutturali, soprattutto dei pavimenti delle stalle di sosta e degli ambienti dove gli animali sostano prima della macellazione possano influenzare l’efficacia dei processi di sanificazione. L’isolamento di uno stesso fagotipo e pulsotipo di S. Typhimurium all’inizio dell’indagine e poi in numero più numeroso nell’ultima partita suina risultata positiva, con un’intervallo di tempo fra i due campionamenti di circa un mese, parrebbe avvalorare l’ipotesi di una contaminazione persistente in tali ambienti. D’altro canto, tenuto presente che gli animali provenivano da uno stesso centro di raccolta, e forse da stessi allevamenti si può anche supporre che gli animali fossero stati esposti alla stessa fonte di contaminazione prima dell’arrivo al macello. Relativamente alle caratteristiche dei ceppi, i sierotipi dai noi isolati da suini sono quelli per i quali è segnalata una maggior circolazione nella stessa specie, sia in base al Monitoraggio condotto nella CE, sia dai dati nazionali derivanti dall’ultimo Report 2009 ENTER-VET (4). Relativamente ai fagotipi di S. Typhimurium, il fagotipo DT193 è fra quelli più frequentemente isolato fra i suini, mentre il DT120 è segnalato presente a partire dal 2009. Circa gli isolamenti da carcasse ovine, i ceppi di S. Typhimurium, talvolta isolati anche da una stessa carcassa, sono risultati appartenere a più fagotipi, diversi da quelli isolati dai suini e non segnalati circolanti in Italia negli ultimi tre anni in base al Report ENTER-VET 2009 (4). Tali riscontri ci permettono da una parte di escludere una cross-contaminazione fra linea ovina e suina nell’ambito del macello, ancora a conferma di una buona conduzione dell’impianto stesso, dall’altra ci inducono a pensare che le partite di ovini fossero contaminate all’origine. A supporto di tale ipotesi vi è anche il mancato isolamento di salmonelle dalla partita 3, campionata sia al 3° che al 4° controllo e quindi rimasta nelle stalle di sosta per oltre una settimana.
SUMMARY
Environmental samples and swabs, from pork and lamb carcasses were collected as defined by Regulation 2073/2005 in a slaughterhouse, by the official veterinarian. These controls were aimed to verify the hygienic conditions of the manufacturing process. The samples collected were analyzed for Salmonella spp. and Enterobacteriaceae. The count of Enterobacteriaceae was always below the limits of acceptability. Indeed, Salmonella was isolated from 28% of pig carcasses and from 17% of sheep carcasses. Environmental samples resulted always negative. Salmonella strains isolated were subjected to serotyping, phage-typing and molecular sub-typing by PFGE. Based on our data, it could be attributed the presence of Salmonella spp. to the poor health status of animals or to the persistence of Salmonella in leirage.
Tabella 1 SUINI
Serie Carcassa N. ceppi Sierotipi e fagotipi
1 1 3 S. ent. subsp.ent. (9,12: l,v:-) S. Typhimurium DT193 S. Anatum
2
1 3 S. ent subsp.ent. (9,12: l,v:-)
2 2 S. Typhimurium DT193
4 5 S. Typhimurium DT193 S. Typhimurium RDNC S. Havana
5 3 S. Typhimurium DT193 S. Typhimurium DT120 S. Typhimurium RDNC 3 1 4 S. Brandenburg 4 4 5 S. Brandenburg 5 4 S. Brandenburg 5 2 3 S. Typhimurium DT193 3 2 S. Typhimurium DT193 S. Brandenburg Tabella 2 OVINI
Serie Carcassa N. ceppi Sierotipi e fagotipi
2 1 2 S. Enteritidis PT13A 5 1 2 S. Typhimurium DT8 2 2 S. Typhimurium DT8 3 4 S. Typhimurium DT8 S. Typhimurium DT30 4 2 S. Typhimurium DT30 5 1 S. Typhimurium DT30
1. Anon 2005 Regolamento della Commissione (CE) del 15
novembre 2005 (2073/2005) GU Unione Europea L338, 1-26
2. Report of the Task Force on Zoonoses Data Collection on the
analysis of the baseline survey on the prevalence of Salmonella
in slaughter pigs, Part A, The EFSA Journal (2008) 135,1-111
3. De Busser E.V.,Maes D.,Houf K., Dewulf J.,Imberichts H.,
Bertrand S., DeZutter L.(2011)“Detection and characterization of Salmonella in lairage, on pig carcasses and intestines of five slaughterhouses” Int.J.Food Microbiol. 145,279-286
4. Anon.“ENTER-VET Report 2009” IZS delle Venezie Centro di