Magnabosco C., Civettini M., De Battisti C., Cattoli G. e Arcangeli G.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie- Legnaro (Pd);
Keywords: Frodi alimentari, prodotti ittici, PCR.
INTRODUZIONE: In questi ultimi anni la richiesta di prodotti della pesca è notevolmente aumentata. A seguito della globalizzazione dei mercati ed alla conseguente importazione da ogni parte del mondo di prodotti ittici, deve essere posta particolare attenzione alla conformità delle specie rispetto a quanto dichiarato in etichetta.
Se una specie ittica viene sostituita con un’altra, il danno per il consumatore è prima di tutto di tipo economico-commerciale (sostituzione con una specie di minor pregio). Sono possibili anche risvolti che possono causare danni alla salute del consumatore come è il caso di sostituzione con specie tossiche. Le normative in materia di rintracciabilità dei prodotti ittici (Reg. CE 104/2000, Reg. CE 2065/2001, Reg. UE 178/2002) nonché i principi ispiratori dei Regolamenti UE n. 852, 853 e 854/2004 applicati dal gennaio 2006 ed i decreti nazionali sulla corretta nomenclatura in Italia sono la dimostrazione di come oggi più che mai il consumatore ha il diritto di conoscere quello che giunge sul suo piatto, ed essere tutelato. L’ultimo D.M. Mipaaf emanato il 23 dicembre 2010 (G.U. n.11 del 15-1-2011) è stato integrato da un comunicato pubblicato sulla G.U. n. 125 del 31-5-2011. In totale, le specie oggetto di nomenclatura ufficiale in Italia sono 934.
Negli anni 2009-2011 sono stati analizzati dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie prodotti ittici in commercio presenti sul mercato nazionale per verificare la corrispondenza della nomenclatura dichiarata alla vendita di varie specie ittiche con metodo PCR seguito da sequenziamento. La percentuale di prodotto non conforme è stata pari al 32%.
SUMMARY: during these last decade, the globalization has modified rapidly the fishery products trade. For this reason, nowadays the consumer is more exposed to the frauds for species substitution. The traceability of fishery products is planned in EU Regulements (Reg. CE 104/2000, Reg. CE 2065/2001, Reg. UE 178/2002) and must be applied in all EU countries. In this study we investigated the presence of frauds in Italian markets, in the period: 2009-2011. The analysis were carried out with PCR method and every sample has been sequenced. The results demonstrate the presence of 32% samples not in according with the declared species. No toxic species were recovered.
MATERIALI E METODI: I campioni sono stati analizzati secondo il seguente approccio: 1) in caso di specie dichiarate presenti anche nella banca delle specie ittiche dell’istituto (cp conservati in alcool 70 °C identificati a partire da pesci interi e classificati in base alle caratteristiche morfologiche secondo le chiavi FAO da personale qualificato), la prova è stata eseguita in doppio con l’omologo campione di riferimento. 2) in caso di specie non presenti nella banca delle specie ittiche dell’istituto si è proceduto in singolo.
Geni target utilizzati per l’analisi di sequenziamento: Citocromo ossidasi I (COI) e Citocromo B (CytB) . Entrambi fanno parte
del genoma mitocondriale e sono utilizzati comunemente nell’ambito della filogenetica molecolare presentando dei polimorfismi di sequenza adatti alla discriminazione di specie. Oggi il COI è considerato il locus di riferimento delle maggiori campagne internazionali di barcoding (BOLD), ciò ha fatto si che nei database pubblici siano presenti sequenze di riferimento certe per un numero molto elevato di specie. Nel nostro laboratorio quindi si usa di routine amplificare e sequenziare un tratto di circa 700 paia di basi di tale locus. In casi particolari viene amplificato e sequenziato anche un tratto di circa 360 bp del CytB per esempio quando un’elevata degradazione del DNA del campione di partenza non permette l’amplificazione di un tratto di lunghezza maggiore o quando la limitata variabilità interspecifica del COI in alcuni generi (es. Thunnus) non garantisce la discriminazione di specie mediante l’esclusiva analisi della sequenza di tale locus. Il DNA del campione in esame è stato estratto mediante il kit QIAampDNA Mini Kit (QIAGEN) seguendo le istruzioni fornite dal produttore. Le reazioni di amplificazione hanno compreso per entrambi i loci 1 U di Platinum Taq DNA polymerase, (Invitrogen), 1 X di PCR rxn Buffer (Invitrogen), 2.5 mM di MgCl2, 0.25 mM di ciascun dNTP, 0.5 mM di entrambi i primers e 5 ml di DNA estratto, per un volume finale di 50 ml. Primers utilizzati: COIfishF1 5’-TCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC-3’ e il COIfishR1 5’-ACTTCYGGGTGRCCRAARAATCA-3’ (Fish Barcode of Life Initiative, FISH-BOL) per il COI e CytB1 5’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’ e CytB2 5’-gcccctcagaatgatatttgtcctca-3’(Carr S.M., Marshall H.D., 1991) per il cytB. L’amplificazione è stata eseguita nel termociclatore GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) con le seguenti condizioni: 2 min a 95°C; 30 sec a 95°C, 30 sec a 52°C e 1 min a 72°C per 35 cicli; 10 min a 72°C. L’avvenuta amplificazione è stata rilevata successivamente a corsa elettroforetica in gel di agarosio all’1% addizionato di Bromuro d’Etidio (0.5 mg/ml), mediante esposizione a luce UV e acquisizione dell’immagine con apparato GelDocXR (Biorad). Dettaglio della prova di sequenziamento: Il prodotto di amplificazione ottenuto è stato quantificato e purificato per poter essere sottoposto alla reazione di sequenziamento. La purificazione è stata ottenuta tramite l’uso del kit commerciale “ExoSap-IT” (USB) seguendo le indicazioni del fornitore. Nel caso di prodotti di PCR contenenti bande multiple e aspecifiche, si è proceduto con l’estrazione della banda della lunghezza attesa tramite l’uso del kit “Qiaquick Gel Extraction” (Qiagen) e la sua successiva quantificazione.
L’amplificato purificato è stato quindi sottoposto a reazione di sequenziamento utilizzando entrambi i primers di amplificazione, ottenendo così due sequenze complementari (figura del ferogramma). Per la reazione di sequenziamento si è utilizzato il kit “BigDye Terminatorv3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems) in un volume finale di 10 µl contenenti: 1 µl di primer specifico (concentrazione 3.3 µM), 1,5 µl di Sequencing Buffer, 1 µl di TRRM, da 1 a 6,5 µl di DNA (a seconda della quantità dell’amplificato). La mix così ottenuta
è stata sottoposta ad una reazione di PCR con le seguenti condizioni termiche: 25 cicli di 96°C per 10 secondi, 50°C per 5 secondi e 60°C per 2 minuti.
Il prodotto di amplificazione della reazione di sequenza è stato successivamente purificato per la rimozione dei reagenti in eccesso. A seconda del numero di amplificati da sequenziare sono stati utilizzati due diversi kit commerciali: “AutoSeq G-50 Dye Terminator Removal” (GE-Healthcare ) nel caso di un numero limitato di amplificati, “Performaâ DTR Ultra 96- Well Plates (Edge Biosystem) nel caso di un numero elevato di amplificati da analizzare. I campioni così ottenuti sono stati caricati nel sequenziatore (ABI Prism 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) per l’elettroforesi capillare. Le sequenze ottenute (figura della sequenza) sono state analizzate con i softwares dedicati Sequencing Analysis 5.2 e SeqScape v2.5 seguendo le specifiche del fornitore.
RISULTATI E DISCUSSIONE:
Nel triennio 2009-2011, su un totale di n. 200 campioni analizzati e tutti sequenziati, n 64 sono risultati non conformi alla specie dichiarata, pari ad una percentuale del 32 %. Le specie più oggetto di sostituzione sono state:
Merluzzo (Merluccius merluccius), sostituito con Merluzzo sudafricano e altre specie; Cernia ( e Cernia atlantica, oggetto di varie sostituzioni; Platessa (Pleuronectes platessa), sostituita da Passera del Pacifico (Lepidopsetta polixistra) e Limanda (Limanda aspera); Tonno rosso (Thunnus thinnus), sostituito da Tonno a pinne gialle (Thunnus albacares); Polpo (Octopus vulgaris), sostituito da Polpo messicano (Octopus maya), Polpo indopacifcio (Octopus aegina e Octopus cyanea); Halibut (Hippoglossus hippoglossus), sostituito da Pangasio (Pangasius hypophtalmus); Dentice (Dentex dentex), sostituito con varie specie.
La frode di gran lunga più frequente è stata quella per sostituzione con specie di minor pregio come nel caso di merluzzi, cernie e platesse. La tipologia di presentazione di queste specie è spesso profondamente modificata: bastoncini, tranci, filetti panati che si prestano appunto a facile frode. Non sono state trovate sostituzioni con specie tossiche con dirette implicazioni sulla salute del consumatore.
RINGRAZIAMENTI: Il presente lavoro è stato condotto anche grazie alla collaborazione di Eurofishmarket S.r.l.
BIBLIOGRAFIA
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IMPIEGO DEL DNA BARCODING PER L’IDENTIFICAZIONE DI SPECIE DI PESCI IN ITALIA
Cutarelli A., Amoroso M.G., Girardi S., De Roma A., Guarino A., Galiero G., Corrado F.Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Via Salute 2, Portici (NA) .
Keywords: DNA mitocondriale, identificazione di specie, DNA barcoding
ABSTRACT
We carried out bi-directional sequence analysis to try to unambiguously classify the most common fishes traded in Italy, mainly all populating the Mediterranean sea. In particular, we sequenced two standard barcode regions of mitochondrial cytochrome b gene (cyt b) and cytochrome oxidase subunit I gene (COI). With both the genes we could correctly identify the species of almost all (31/32) the samples in study.
INTRODUZIONE
L’identificazione di specie rappresenta un aspetto fondamentale della sicurezza alimentare nei prodotti ittici. In Italia questo problema è particolarmente sentito per i prodotti trasformati (ad es. filetti di pesce panati) per la frequente sostituzione di specie di valore elevato con altre di valore più basso e la conseguente errata dichiarazione in etichetta. La corretta determinazione di specie ha notevoli applicazioni a tutela dei consumatori, essa può infatti essere anche utilizzata nella individuazione di specie potenzialmente tossiche o allergizzanti così come di specie provenienti da aree inquinate da bio-tossine termoresistenti.
Nel nostro paese le specie di pesce sono identificate attraverso valutazione delle caratteristiche morfologiche (Legge No. 125 del 25.03.1959). Purtroppo però tale identificazione è impossibile per i prodotti trasformati, (che rappresentano in Italia circa la metà del pesce consumato), in cui i caratteri morfologici sono ormai inesistenti (1). In tale contesto appare chiara la necessità di disporre di un metodo analitico che consenta di analizzare qualsiasi prodotto alimentare a base di pesce (indipendentemente dal processo tecnologico subito) e fornire indicazioni veloci e chiare sulle specie di pesce che lo compongono allo scopo di garantire il consumatore sulle origini e la sicurezza dei prodotti alimentari ittici consumati. A questo riguardo, si stanno sviluppando in maniera molto rapida negli ultimi anni metodi molecolari di indagine (DNA barcoding) che si basano sull’analisi di sequenze polimorfiche di DNA del genoma mitocondriale. Il DNA barcoding è già impiegato con successo per l’identificazione di specie in molti campi: medico, forense, alimentare, (2). I maggiori vantaggi di questo tipo di analisi sono l’elevata sensibilità (detection anche di poche molecole di DNA), la presenza di differenze nelle sequenze di DNA anche tra specie filogeneticamente molto correlate, nonché l’elevata resistenza degli acidi nucleici ai processi tecnologici alimentari tipici dei prodotti ittici (affumicatura, cottura, acidificazione, salagione, congelamento) (3, 4 ). Nel presente lavoro abbiamo analizzato, tramite DNA barcoding, 32 prodotti ittici costituiti prevalentemente da pesci (interi o tranci) pescati nel Mar Mediterraneo (30 campioni). Abbiamo poi anche analizzato dei prodotti trasformati (2 filetti di pesce panati) con lo scopo di valutare l’applicabilità del DNA barcoding anche a questo tipo di preparazioni. Come markers genetici abbiamo impiegato il gene del citocromo b (cyt b) e il gene del citocromo ossidasi sub unità I (COI) dal momento che queste sequenze mitocondriali sono quelle maggiormente impiegate per l’identificazione di specie nei pesci (1, 3, 5).
MATERIALI E METODI
2.1 Campionamento ed analisi morfologica
I campioni sono stati raccolti dalla sezione di Salerno dell’ Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno. Laddove possibile i Veterinari della sezione hanno effettuato l’identificazione di specie sulla base delle caratteristiche morfologiche. Ogni campione è stato fotografato dorsalmente e ventralmente per catturare tutti dettagli utili ai fini della identificazione. In seguito i campioni sono stati inviati (previo congelamento) al laboratorio di Analisi del Genoma, presso la sede centrale dell’Istituto Zooprofilattico.
2.2 Estrazione del DNA e PCR
IL DNA è stato estratto dai campioni in esame (200 mg) mediante il kit “High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche®)”. Il DNA mitocondriale da cyt b) e COI è stato amplificato mediante i primers indicati in tabella 1
Tabella 1. Primers impiegati per la PCR e il sequenziamento Target Primers c y t - b 435 bp cyt bF: 5’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA -3’ cyt bR: 5’-CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA -3’ (6) C O I -616 bp FishF1: 5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC -3’ Fish R1: 5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA -3’ FishF2: 5’-TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC -3’ FishR2: 5’-ACTTCAAGGGTAACCGAAGAATCAGAA -3’ (7,8).
La mix di reazione (50µL) includeva: 25µL di Master Mix 2x (Applera), 1µL di ogni primer (10µM), 18µL di acqua DNAse/ RNAse free e 100 ng del DNA estratto. Il profilo termico di reazione per i primer FishF1/FishR1 era il seguente: 1° step di denaturazione di 15 min a 95°C, 35 cicli di: 30 sec a 94°C, 40 sec a 52°C, e 1 min a 72°C, uno step di elongazione finale di 10 min a 72°C. Il profilo termico per i primer FishF2/ FishR2 prevedeva, rispetto al suddetto, solo un differente step di annealing (54°C per 30 sec invece di 52°C per 40 sec). Il profilo termico di reazione per i primers cyt bF/cyt bR era invece: 1° step di denaturazione di 15 min a 95°C, 40 cicli di: 1 min a 95°C, 30 sec a 48°C, 1 min a 72°C e uno step di elongazione finale di 7 min a 72°C. I prodotti di PCR dopo essere sono stati visualizzati su un gel di agarosio al 2% sono stati sottoposti a sequenziamento
2.3 PCR di sequenziamento e DNA barcoding
I prodotti di PCR sono stati purificati mediante Qiaquick PCR purification Kit (Qiagen) e successivamente sottoposti a PCR di sequenziamento bi-direzionale utilizzando il kit di sequenziamento ABI PRISM Big Dye3.1 Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) secondo le istruzioni contenute nel kit. Le sequenze sono state poi purificate del Dye terminator mediante DyeEX 2.0 spin kit (Qiagen) e infine sottoposte a elettroforesi capillare con lo strumento ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Gli
Elettroferogrammi sono stati analizzati mediante software SeqScape v.2.5 (Applied Biosystems). Le sequenze ottenute dal gene COI sono state analizzate attraverso il BOLD Identification System (IDS) (www.boldsystems.org). Le sequenze ottenute dal gene cyt b sono state invece allineate con quelle depositate in BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.org).
RISULTATI E DISCUSSIONE
Ciascun campione in esame è stato sottoposto ad analisi di sequenza con entrambi i markers genetici COI e cyt b. Mediante analisi del COI è stato possibile identificare, inserendo le sequenze ottenute in IDS BOLD, 26 dei 30 campioni di pesce (intero o in trancio) in studio. L’analisi delle sequenze del gene cyt b, allineate in BLAST, ha consentito invece di identificare 27 dei 30 campioni di pesce in esame. In particolare con il COI non si è riusciti a identificare le 3 differenti specie di Pagellus in analisi: erythrinus, bogaraveo e acarne, mentre con il cyt b sono state identificate le due specie di Carangoides campionate: gymnostethoides e fulvoguttatus. In ogni caso, impiegando ambedue i marcatori, è stato possibile identificare geneticamente la specie di tutti i campioni di pesce in analisi tranne uno. Dei campioni analizzati, infatti, solo una specie non ha trovato corrispondenza né in BLAST né in IDS BOLD: la Trigla lucerna ovvero la “gallinella”. Ciò può essere dovuto al fatto che tale specie non era mai stata esaminata fino ad ora e di conseguenza la sua sequenza non era mai stata depositata in nessuno dei due database. Per quanto riguarda i 2 prodotti trasformati in esame, sia COI che cyt b hanno rilevato la presenza in entrambi di Merluccius merluccius. Le specie identificate, con il relativo marcatore, sono riportate in tabella 2.
Tabella 2 Specie di pesce identificate mediante DNA barcoding
ORDINE FAMIGLIA GENERE SPECIE
Marker genetico
Gadiformes Gadidae Micromesistius poutassou cyt b/COI Gadiformes Phycidae Phycis blennoides cyt b/COI Gadiformes Merluciidae Merluccius paradoxus cyt b/COI Gadiformes Merluciidae Merluccius capensis cyt b/COI Gadiformes Merluciidae Merluccius hubbsi cyt b/COI Gadiformes Merluciidae Merluccius merluccius cyt b/COI Perciformes Sparidae Pagellus acarne cyt b Perciformes Scombridae Thunnus albacares cyt b/COI Perciformes Sparidae Pagellus erythrinus cyt b Perciformes Sparidae Pagellus bogaraveo cyt b Perciformes Carangidae Carangoides gymnostethoides COI Perciformes Carangidae Carangoides fulvoguttatus COI Perciformes Triglidae Trigla lyra cyt b/COI Lophiiformes Lophius Lophius piscatorius, cyt b/COI Perciformes Xiphidae Xiphias gladius cyt b/COI Ogni specie analizzata ha mostrato di avere una sequenza genica diversa da quella delle altre specie e chiaramente identificabile mediante DNA-barcoding. Il DNA barcoding è un’indagine genetica semplice da effettuare perché include le più comuni tecniche molecolari (estrazione del DNA, PCR e sequenziamento): è proprio la loro associazione che rende la metodica un tool di successo per l’identificazione di specie e per la tracciabilità dei prodotti alimentari ittici. Sistemi di tracciabilità basati su indagini molecolari si rivelerebbero molto utili specialmente nell’identificazione della composizione di prodotti trasformati, che più facilmente sono oggetto di frode (poiché le parti del pesce non sono più morfologicamente riconoscibili). In conclusione, con il presente lavoro è stato
possibile eseguire un’autenticazione genetica di alcune specie di pesce aventi elevato valore commerciale in Italia. L’analisi è stata realizzata mediante lo studio di alcune sequenze geniche mitocondriali che caratterizzano in maniera pressoché univoca molte specie viventi. Un’importante risvolto dello studio effettuato è dato dalla possibilità di contribuire al progetto DNA barcode. Moltissimi laboratori in tutto il mondo concorrono, infatti, ogni giorno ad arricchire I database di sequenze appartenenti a nuove specie identificate, dando un aiuto importante agli studi filogenetici e tassonomici sugli organismi viventi.
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