Bertolotti L. a, Mazzei M. b, Camero M. c, Profiti M. a, Cavalli A. c, De Meneghi D. a, Carrozza M.L. d, Perona G.e, Rosati S.a
a. Dipartimento di Produzioni Animali Epidemiologia ed Ecologia, Università degli Studi di Torino b. Dipartimento di Patologia Animale, Profilassi ed Igiene degli Alimenti, Università di Pisa
c. Dipartimento di Sanità pubblica e zootecnia, Università di Bari d. Scuola Normale Superiore, Pisa
e. CISRA - Centro Interdipartimentale Ricovero Animali, Università degli Studi di Torino
Keywords: Lentivirus, Roccaverano, vaccinazione, carica provirale
SUMMARY This study shows for the first time that goats experimentally infected with SRLV Roccaverano strain and challenged with a virulent CAEV strain, develop an adaptive immune response able to reduce CAEV-CO proviral load, in some cases to an undetectable level. Thus, immunisation using low pathogenic strains (genotype E) confers a degree of protection at the proviral load level against pathogenic strains (CAEV-CO) and may open new chances on SRLV immunisation strategies.
INTRODUZIONE
I lentivirus dei piccoli ruminanti (SRLV) sono attualmente classificati in 5 genotipi (da A ad E). Il genotipo di più recente identificazione (genotipo E) è stato rilevato in alcuni nuclei caprini in Piemonte e Sardegna ed è caratterizzato da due grosse delezioni nel genoma, corrispondenti alla subunità dUTPasi del gene pol e al gene accessorio VPR-like. Ciò sembra conferire una ridotta virulenza, in analogia a quanto osservato sperimentalmente su ceppi artritici in cui tali subunità sono state artificialmente delete. Inoltre fra i ceppi appartenenti al genotipo E, lo stipite Roccaverano appare ulteriormente attenuato per la incapacità di replicare al di fuori della linea monocito-macrofagica. Questo sembra essere il risultato di un adattamento del virus in una popolazione caprina isolata e progressivamente ridottasi a pochi esemplari. Mutazioni nelle regioni ipervariabili del gene env ed esperimenti in vitro indicano che il ceppo Roccaverano utilizza un diverso recettore cellulare sui macrofagi, non presente sui fibroblasti.
In vivo il cluster virale riconducibile al prototipo Roccaverano è presente in poche decine di esemplari ed è strettamente associato alla razza caprina autoctona da cui prende il nome, viene trasmesso esclusivamente per via verticale e si mantiene in alcune linee familiari. La razza Roccaverano è sempre stata considerata resistente alle infezioni da SRLV, in particolare verso i ceppi artritici appartenenti al genotipo B (CAEV-like), introdotti nella Langa astigiana negli anni ottanta con l’importazione di razze caprine francesi. Tale considerazione, alla luce di quanto scoperto recentemente, suggerisce una ulteriore suggestiva ipotesi e cioè che una precedente esposizione al ceppo Roccaverano conferisca una resistenza su base immunologica verso ceppi eterologhi. In un precedente lavoro abbiamo dimostrato che la risposta immunitaria in soggetti sperimentalmente infettati con il ceppo Roccaverano si sviluppa in modo classico (umorale e cellulo-mediata), ma solo l’attività citotossica mediata dai CD8 risulta attiva verso ceppi eterologhi.
Nel presente lavoro abbiamo sperimentalmente riprodotto la doppia infezione, mediante vaccinazione con ceppo Roccaverano e challenge con ceppo CAEV-Cork. I parametri sierologici sono stati valutati per una conferma dell’avvenuta infezione ed i parametri virologici, come carica provirale del ceppo challenge nel sangue periferico, per valutare se vi fossero differenze significative fra il gruppo vaccinato ed il gruppo di controllo.
MATERIALI E METODI
Disegno sperimentale
Sono stati selezionato in totale 22 animali, divisi in tre gruppi omogenei per età: 8 animali vaccinati con virus vivo attenuato ceppo Roccaverano (gruppo A), 8 animali non vaccinati (gruppo B); 6 animali di controllo (gruppo C).
In base a esperienze maturate in un precedente esperimento pilota su 4 soggetti, si è scelto di inoculare il vaccino per via intratracheale. Infatti, sebbene il midollo osseo rappresenti una riserva di promonociti in attiva replicazione e quindi l’inoculazione per via midollare esiti in una rapida e solida sieroconversione, è stata scelta la via intratracheale perché ritenuta più pratica e meno invasiva. Le otto capre del gruppo A sono state sottoposte a vaccinazione con virus vivo attenuato alla dose di 5x105 TCID50/2ml per via intratracheale. Dopo 4 mesi, sia le capre del gruppo A che le capre del gruppo B sono state infettate con virus challenge inoculato nell’articolazione del carpo destro.
Analisi sierologica
I prelievi di sangue sono stati effettuati a cadenza settimanale per il primo mese post vaccinazione, bisettimanale per il successivo mese e mezzo, mensile per successivi due mesi; i restanti prelievi sono stati eseguiti a distanza di un mese e mezzo l’uno dall’altro, per un totale di 14 prelievi.
I campioni di sangue sono stati prelevati utilizzando la vena giugulare e adoperando provette Vacutainer con EDTA per la raccolta del plasma e del buffy coat.
Il plasma di ogni prelievo è stato testato per la presenza di anticorpi verso le porzioni immunodominanti delle proteine di matrice (p25) e del capside (p16) e della regione variabile SU5 della proteina dell’envelope.
Carica provirale
Da ogni campione di buffy coat è stato estratto il DNA genomico mediante kit commerciale (Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit). Il DNA è stato quantificato con metodo spettrofotometrico o fluorimetrico (NanoDrop 2000c, PicoGreen dsDNA Assay Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA). Cinquecento nanogrammi di DNA sono stati usati come templato per due diversi saggi RealTime PCR, al fine di valutare la carica provirale nel sangue degli animali considerati. Brevemente, due diversi protocolli qRealtime PCR sono stati ottimizzati utilizzando la metodica Taqman, diretti ad amplificare e identificare due regioni geniche diverse del DNA provirale integrato: le regioni interne di gag (protocollo 1) e di pol (protocollo 2). Sono state usate come target di sonde genotipo- specifiche sia in PCR simplex (1) che in duplex (2). Al fine di quantificare il numero assoluto di copie di DNA provirale integrato, i valori di cycle threshold (ct) di ogni campione sono stati confrontati con una curva standard ottenuta da concentrazioni crescenti di un plasmide di controllo e ottimizzata per ogni stipite virale. Ogni prelievo di ciascun animale è stato testato con entrambe le metodiche. I risultati sono stati analizzati confrontando le cariche
provirali negli animali appartenenti al gruppo A e B, in modo da evidenziare eventuali differenze. Le cariche provirali dei due gruppi sono state confrontate utilizzando il test statistico Wilcoxon- Mann-Whitney, considerando ogni prelievo.
RISULTATI
La sieroconversione è stata valutata utilizzando un primo test ELISA indiretto basato su un antigene ricombinante formato dalla fusione delle proteine della matrice e del capside (p16-25) per i genotipi B ed E, e successivamente utilizzando peptidi sintetici disegnati sulla base delle sequenze dell’epitopo SU5 di entrambi i genotipi. Tutti gli individui vaccinati (gruppo A) hanno mostrato un aumento della carica anticorpale nei confronti del genotipo E e, successivamente al challenge, nei confronti del genotipo B. Gli animali non vaccinati (gruppo B) hanno sieroconvertito nei confronti del genotipo B a partire del 14° giorno post challenge. Negli animali del gruppo B il titolo anticorpale nei confronti del genotipo E si è sempre mantenuto intorno a valori nulli, dimostrando l’assenza di cross-reazione anticorpale fra antigeni eterologhi (Figura 1).
La stima della carica provirale dei ceppi Roccaverano e CAEV- Cork ha permesso di valutare l’efficacia della vaccinazione con il ceppo Roccaverano nei confronti di una superinfezione da parte del ceppo artritico CAEV.
Entrambe le metodiche di qRealtime PCR hanno evidenziato come gli animali precedentemente vaccinati con il ceppo virale Roccaverano presentino un numero di copie del provirus CAEV-Cork significativamente inferiore rispetto agli animali non vaccinati. In maggiore dettaglio, a partire da 141 giorni post infezione, corrispondente al prelievo numero 9, la differenza tra i valori di carica provirale CAEV (espressa in numero di copie per nanogrammi di DNA estratto) negli animali del gruppo A e del gruppo B, risulta statisticamente significativa (Wilcoxon-Mann- Whitney p < 0.05) nei tempi 9, 10, 12, 13 e 14.
DISCUSSIONE
I risultati ottenuti in questo studio dimostrano che animali vaccinati con il ceppo a bassa patogenicità Roccaverano e infettati con il ceppo artritico CAEV Cork sieroconvertono in modo convenzionale verso quest’ultimo, sia in termini di precocità che di carica anticorpale. Tuttavia, analizzando la carica provirale del ceppo challenge mediante l’utilizzo di due diverse metodiche realtime si evince che nel gruppo di animali vaccinati risulta statisticamente più bassa rispetto al gruppo di controllo. Questo aspetto è particolarmente importante da un punto di vista biologico: infatti, è da considerare che la carica provirale condiziona i tempi e l’entità della colonizzazione del virus nelle sedi periferiche, con implicazioni cliniche e epidemiologiche. E’ noto dalla letteratura che animali che presentano cariche provirali maggiori, sviluppano forme cliniche più precoci e gravi, mentre la modesta colonizzazione in alcune sedi periferiche potrebbe ridurre la diffusione dell’infezione per via orizzontale.
L’utilizzo di un ceppo attenuato antigenicamente differente dal ceppo challenge rappresenta una strategia nuova mai provata fino ad oggi. La mancata cross-reattività degli anticorpi rilevati sia verso le proteine gag che env dei due virus sembra infatti vantaggiosa ai fini protettivi. E’ stato dimostrato in precedenti studi che animali vaccinati con stipiti inattivati omologhi al ceppo challenge inducevano lesioni immunomediate più gravi rispetto al gruppo di controllo. Nel nostro esperimento, l’unica cross- reattività sembra coinvolgere epitopi riconosciuti dai CD8 che ben spiegherebbe la bassa carica virale nelle sedi di persistenza dell’infezione. In conclusione questo studio sperimentale offre una nuova interpretazione per spiegare la resistenza della razza Roccaverano verso i ceppi CAEV-like e pone le basi per un
razionale sviluppo di una nuova generazione di vaccini attenuati per SRLV.
RINGRAZIAMENTI
Il presente lavoro è stato finanziato da: PRIN 2008; Regione Piemonte, Ricerca Sanitaria Finalizzata, anni 2008 e 2009. Si ringrazia il sig. Roberto Maritano, CISRA, per la costante collaborazione nella gestione dei gruppi sperimentali.
Figura 1. Sieroconversione verso l’antigene SU5. sieroconversione verso lo stipite Roccaverano: linea continua// punti; sieroconversione verso lo stipite CAEV: linea tratteggiata// quadrati; range interquartile: linea verticale.
Figura 2. Carica Provirale del ceppo CAEV nel sangue degli animali dei gruppi A e B calcolata a T4, T7-T14. Carica provirale (mediana) nel gruppo A: linea continua//punti; carica provirale (mediana) nel gruppo B : linea tratteggiata//quadrati; range interquartile: linea verticale.
Bibliografia: Reina et al. Vet Immunol Immunopathol 139 (2011) 237–244; Juganaru et al. Virology 410 (2011) 88–95; Grego et al. J Gen Virol (2007), 88, 3423–3427.