Chiaravalle A. E., Miedico O., Laconca L., Pompa C., Tarallo M.
Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, Foggia
Key words: mangimi, ICP/MS, metalli pesanti
SUMMARY
A new method for the determination of 12 metals in matrix of animal feed has been optimized and validated according to an in house validation mode. This analytical method is based on a pretreatment of the sample by micro-wave mineralization followed by analysis with ion coupled plasma mass spectrometry employing dynamic reaction cell (DRC). The most important validation parameters such as specificity, linearity, repeatability, recovery, limit of quantification (LOQ) and uncertainty have been evaluated and good results in terms automation and analysis costs have been obtained.
INTRODUZIONE
La presenza di contaminanti ambientali tra i quali Piombo, Cadmio, Mercurio ed Arsenico nei mangimi rappresenta una delle principali cause di inquinamento dell’intera filiera dei prodotti di origine animale. Infatti la Direttiva CE 32/2002 stabilisce i tenori massimi di tali contaminanti nell’alimentazione degli animali.
Inoltre il controllo della qualità degli alimenti ad uso zootecnico riguarda anche altri elementi fondamentali per i vari processi fisiologici dell’animale e pertanto additivati in opportune concentrazioni (oligoelementi). Tuttavia, poiché l’ingestione di quantità eccessive di oligoelementi può causare seri rischi per la salute degli animali e dei consumatori, è necessario verificare che la concentrazione di tali additivi sia correttamente dichiarata in etichetta. Ciò ha indotto le Autorità Sanitarie Nazionali competenti, in particolare i Servizi Veterinari, ad attivare specifici piani di monitoraggio, come il Piano Nazionale di vigilanza e controllo sanitario sull’Alimentazione Animale (PNAA). L’obiettivo del suddetto programma è di assicurare, in accordo a quanto già stabilito dal Reg. CE 882/2004, un sistema ufficiale di controllo dei mangimi lungo l’intera filiera alimentare al fine di garantire un elevato livello di protezione. La Struttura Complessa CHIMICA di codesto Istituto, già deputata al controllo ufficiale di alimenti e mangimi, ha ritenuto opportuno mettere a punto un metodo innovativo e completo per l’analisi di contaminati ed oligoelementi nei mangimi.
MATERIALI E METODI Preparazione del campione:
500 g di diversi campioni di mangime di varia tipologia (semplici, completi e sfarinati) e destinati all’alimentazione di varie specie animali, vengono macinati e resi omogenei mediante mulino a coltelli; di essi un’aliquota di 0,50 g viene pesata con accuratezza di 0,1 mg in contenitori in teflon (VESSEL) mediante bilancia analitica posta sotto cappa a flusso laminare per evitarne la contaminazione. Si aggiungono 8,0 ml di acido nitrico (HNO3, 68% v/v), 2,0 ml di Perossido di Idrogeno (H2O2, 120 volumi) e 100 µl di acido fluoridrico (HF, 48% v/v) e si posizionano i Vessel all’interno del forno a microonde, dove temperatura e pressione elevate assicurano una dissoluzione rapida e completa dei campioni. In tabella 1 è riportata la sequenza di mineralizzazione. Il processamento contestuale di
un bianco procedurale e di un Materiale di Riferimento o di un campione con aggiunta nota di analiti consente di tenere sotto controllo l’intero processo.
I VESSEL vengono riportati a pressione e temperatura tali da evitare perdite di materiale durante l’operazione di apertura. Le soluzioni di mineralizzazione ottenute vengono trasferite in provettoni in polipropilene da 50,0 ml e portate a volume gravimetricamente con acqua ultrapura.
Step Potenza (Watt) Rampa (min) Press. (psi) Temp. (°C) Durata (min) 1 1200 5,00 400 120 --- 2 1200 --- 400 120 5,00 3 1200 6,00 400 190 --- 4 1200 --- 400 190 20,00
Tab. 1 Programma di Mineralizzazione. Pressione e
Temperatura controllate mediante sensori.
I campioni vengono diluiti 4 volte, prelevando 5,0 ml e aggiungendo 15,0 ml di acqua Ultrapura. Tale diluizione è necessaria per evitare di introdurre nel sistema di ionizzazione (nebulizzatore, torcia e coni) elevate quantità di analiti, che potrebbero compromettere la stabilità di lettura strumentale. Inoltre, date le elevate concentrazioni di taluni analiti, la suddetta diluizione è indispensabile per rientrare nell’intervallo di taratura strumentale di ciascun elemento.
Apparecchiature: Bilancia analitica con accuratezza 0,1 mg, Mulino a coltelli modello FRITSCH Pulverisette 14 congriglia di diametro 0.5 mm, Forno a Microonde con contenitori in PTFE (VESSEL) e Spettrometro di Massa al Plasma Induttivamente Accoppiato con tecnologia di campo assiale con Cella Dinamica di Reazione (modello ELAN DRC II, PerkinElmer) equipaggiato di autocampionatore (CETAC ASX-520).
Reagenti: Acido Nitrico al 68% (v/v) di grado ultrapuro (Romil, Cambridge, GB); Acido Fluoridrico al 48% (v/v) di grado ultrapuro (Merck, Germany), Perossido di Idrogeno a 120 volumi di grado ultrapuro (Romil, Cambridge, GB), Acqua ultrapura (Romil, Cambridge, GB), Argon Ultrapuro (AIR Liquide, Italia), Ammoniaca 100% Anidra (AIR Liquide, Italia), Metano (grado di purezza N 55, AIR Liquide, Italia), Soluzioni Standards di 1000 mg/l (ICP International, Olanda) dei seguenti elementi: Mercurio, Piombo, Cadmio, Cromo, Arsenico, Stagno, Selenio, Nichel, Ferro, Rame, Manganese e Zinco
Le soluzioni per la taratura dello spettrometro di massa vengono preparate prelevando un opportuno volume di standard, acidificate a 2% di HNO3 e diluite con Acqua ultrapura pesata su bilancia analitica.
Condizioni Strumentali dell’ICP/MS: Sistema introduzione
del Campione: Nebulizzatore concentrico di Meinhard; Spray chambre ciclonica in quarzo. Plasma: Generatore Radio Frequenze da 1100 Watt; Flusso di Ar per il Plasma 15,0
lit/min; Flusso di Ar per nebulizzatore da 0,9 a 1,1 L/min; Controllo pompa peristaltica: Sample Flush 60 sec; Sample Flush speeding -32,0 rpm; Read delay 20 sec; Read delay end analysis speeding -20,0 rpm; Wash 45 sec, Wash speeding -32,0 rpm; Condizioni di aquisizione: Dwell time 50 ms; sweeps/reading 20; reading/replicate 1; Replicates 3; Peak Hopping; Standard Interno: Ittrio e Bismuto, aggiunti mediante miscelatore “on-line” agli standard di calibrazione e ai campioni prima della nebulizzazione.
RISULTATI E DISCUSSIONE
La tecnica analitica, per la determinazione di arsenico (As), cadmio (Cd), mercurio (Hg), piombo (Pb), cromo (Cr), stagno (Sn), nichel (Ni), rame (Cu), selenio (Se), ferro (Fe), manganese (Mn) e zinco (Zn) nei mangimi ai fini del controllo ufficiale degli alimenti ad uso zootecnico, è basata sui conteggi delle masse isotopiche1. Per accertare l’applicabilità del metodo sono state studiate le seguenti prestazioni analitiche:
-Specificità: 10 campioni di mangimi sono stati mineralizzati e sottoposti a determinazione strumentale sia tal quali che additivati a opportune concentrazioni dei 12 elementi. E’ stata verificata l’assenza di segnali interferenti significativi in corrispondenza dei valori di rapporto massa/carica a cui vengono rivelati tutti gli analiti. Per gli analiti Fe, Cr, Ni, Cu, Zn e Mn viene adoperata la DRC con ammoniaca: l’immissione in cella di un gas reattivo consente di eliminare selettivamente gli ioni interferenti ed evitare forti sovrastime di molti isotopi. Per la determinazione del Se invece, viene usato il metano, gas maggiormente idoneo come ampiamente riportato in letteratura2. L’isotopo del Selenio considerato è quello a massa 78, poiché l’isotopo 80, pur essendo più abbondante, è maggiormente interferito dal dimero [Ar40-Ar40]+. Infine, per una maggiore sensibilità e stabilità del segnale analitico, la determinazione di Pb, Cd, Hg, Sn ed As, viene eseguita in modalità STANDARD cioè senza utilizzo della DRC. Anche se in realtà per l ’As esistono interferenze spettrali dovute al Cloro3, la diluizione eseguita in fase di lettura strumentale permette di ovviare a tali problemi.
-Linearità: Avendo a disposizione degli standard mono- elemento, è stato possibile scegliere il range di calibrazione specifico per ciascun analita, in base ai livelli di concentrazione presenti nella maggior parte dei mangimi. Infatti per i contaminanti, di solito presenti in tracce, è stato scelto un intervallo a basse concentrazioni mentre per gli oligoelementi un range a più alta concentrazione (Tabella 2).
Analita Concentrazione (ng/ml) Pb, Cd, Cr, As, Se, Sn, Ni 0,50- 50 Hg 0,10- 10 Cu 2,0 – 200 Fe, Mn e Zn 10,0 – 1000
Tab 2 range di concentrazione di ciascun analita
E’ stata dimostrata la relazione lineare tra il segnale e la concentrazione, costruendo tre curve di taratura indipendenti (bianco di calibrazione e 4 soluzioni standard a titolo noto) e verificando che la curva media avesse determinati requisiti: intercetta non significativamente diversa da 0, R2 > 0.999, rapporti segnale/concentr. non significativamente diversi. -Limite di quantificazione (LOQ): è stato calcolato come 10 volte la deviazione standard della concentrazione di 20 bianchi
campioni, tenendo conto della pesata media e della diluizione. I valori dei LOQ in matrice sono riportati in tabella 3. Da notare che, pur utilizzando una tecnica molto sensibile (ICP-MS), i valori di LOQ sono piuttosto elevati a causa della limitata presa analitica e del fattore di diluizione.
ANALITA Hg Pb Cd As Cr Sn LOQ (mg/ kg) 0.03 0.02 0.0048 0.16 0.05 0.29 ANALITA Ni Se Cu Fe Mn Zn LOQ (mg/ kg) 0.47 0.07 0.85 2.23 0.25 2.5
Tab.3 Valori di LOQ calcolati in matrice considerando una
pesata analitica di 0,5 g , un volume finale di preparazione di 50 ml e una diluizione di 4 volte
Si può notare che per Fe, Zn e Cu i valori sono sensibilmente maggiori; tuttavia i tre analiti, in quanto oligoelementi, sono generalmente presenti in concentrazioni superiori ai rispettivi LOQ. Invece, per i contaminanti Pb, Cd, Hg, Cr e As, i LOQ sono ragionevolmente contenuti.
-Ripetibilità: è stata valutata mediante l’analisi in 6 replicati di 8 campioni di mangimi, con altrettanti livelli di concentrazione per ogni elemento. Per ogni campione (e quindi per ogni livello di concentrazione) è stata calcolata la concentrazione media e lo scarto tipo per ciascun analita. Infine, mediante interpolazione lineare, è stata ricavata l’equazione della retta che descrive l’andamento della deviazione standard in funzione della concentrazione. Per tutti gli otto campioni sono stati soddisfatti i requisiti di ripetibilità, in particolare i valori di HORRATr sono tutti inferiore a due. In tabella 4 si riportano i valori di HORRATr per alcuni elementi, nell’esempio di 0.50 mg/kg .
Analita Dev. Std. in funzione della concentrazione R2 HORRATr (0,50 mg/kg, CV%H=18%) Pb 0,0951*Conc. 0,97 0,53 Cd 0,0485* Conc. 0.98 0,27 As 0,0829* Conc. 0.93 0,46 Se 0,0757* Conc. 0,96 0,42 Sn 0,0775* Conc. 0.95 0,43
Tab 4 Valori di R2, HORRAT
r ed equazioni delle rette per
Piombo, Cadmio, Arsenico, Selenio e Stagno
-Recupero: non disponendo di una matrice di riferimento certificata simile a quella da analizzare, è stato utilizzato un campione di mangime reale, additivato secondo opportune concentrazioni dei 12 metalli nella fase precedente alla mineralizzazione. Il recupero dell’intero metodo di prova è stimato come rapporto tra i valori trovati nelle prove di lettura ed i valori teorici. I valori di recupero ottenuti per ogni analita variano da 85% a 103%. Si precisa tuttavia che i risultati finali non vengono corretti per il recupero.
-Incertezza di Misura: i valori d’incertezza di misura estesa (fattore di copertura k=2 e livello di confidenza p~0,95) sono stati calcolati mediante approccio metrologico considerando i seguenti contributi: ripetibilità, taratura metrologica, incertezza
sul criterio di accettabilità di taratura, pesata, fattore di diluizione e materiali standard certificati. I contributi maggiori sono dovuti ai primi tre parametri. I valori di incertezza estesa sono compresi tra il 14% del Ferro e il 23% del Rame.
CONCLUSIONI
Non avendo a disposizione dei materiali certificati, il suddetto metodo, una volta validato secondo la metodica sopra descritta, è stato verificato utilizzando dei materiali di riferimento di composizione alquanto simile ai mangimi semplici: NIST 1567 (wheat flour) prodotto dalla National Bureau of Standard, IAEA-V-8 (rye flour) e IAEA-155 (whey powder) prodotti dall’IAEA. In questo lavoro è stato messo a punto un metodo analitico basato su una tecnica molto sensibile e versatile (DRC-ICP-MS) che consente di determinare contemporaneamente il contenuto di 12 elementi tra cui metalli pesanti ed oligoelementi. L’utilizzo di una tecnologia avanzata, quali la cella dinamica di reazione consente di risolvere i problemi peculiari della spettrometria di massa (interferenze isobariche poliatomiche). Un altro punto di forza consiste nell’applicabilità del metodo ad ogni tipologia
di mangime (sia esso semplice, composto o integrato) e agli alimenti ad uso zootecnico destinati alle varie specie animali (ovini, caprini, suini, equini, pollame, bovini e pesci).
RINGRAZIAMENTI: Si ringrazia per il contributo professionale il Sig. Michelangelo D’Errico, dipendente di codesto Istituto in qualità di perito Chimico.
BIBLIOGRAFIA
1. Cubadda F., Inductively coupled Plasma-Mass Spectrometry for the Determination of Element and Element Species in Food: a Review, Journal of AOAC International (2004), Vol.87 (32)
2. Pruszkowsky E., Selenium determination in blood and serum with ICP-MS, Field application Report (Perkin Elmer).
3. Nixon D.E., Neubauer K. R., Eckdahl s.J., Butz J.A., Burritt M.F., Comparision of tunable bandpass reaction cell inductively coupled plasma mass spectrometry with conventional inductively coupled mass spectrometry for the determination of heavy metals in whole blood and urine, Spectrochimica ACTA Part B59 (2004), 10