Bassi S.1, Paganelli G. L.1, Carpana E.2, Gelmini L.1, Salogni C.3, Carra E.1
1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia-Romagna – Via Diena 16, Sezione di Modena
2 Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura – Unità di Ricerca di Apicoltura e Bachicoltura – Via di Saliceto 80, Bologna 3 Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia-Romagna – Via A. Bianchi 7/9, Brescia
Key words: American foulbrood, Genotypes ERIC I and ERIC II, Paenibacillus larvae
SUMMARY
Recently it has been demonstrated the existence of genotypes of Paenibacillus larvae with different virulence and phenotype. The recognition of the phenotypic characteristics of these genotypes is crucial for a correct laboratory diagnosis. Also the knowledge of the strains circulating in a given area is important because the different pathogenicity can affect the expression of some aspects of the disease. Here we show the results of the characterization of some strains of P. larvae isolated in our Institute in 2010.
INTRODUZIONE
Paenibicillus larvae (P.larvae), batterio sporigeno Gram +, è l’agente causale della Peste Americana (PA) delle api (3). Gli studi di caratterizzazione genetica con applicazione di diverse tecniche biomolecolari hanno messo in evidenza la presenza di diversi genotipi di P. larvae (4, 6, 7).
La PCR con impiego di Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC) primers consente di identificare quattro differenti patterns denominati ERIC I - II - III - IV (3).
Questi genotipi oltre ad avere diverse caratteristiche fenotipiche differiscono anche per la loro virulenza (5).
La diversa virulenza sembra condizionare la progressione della malattia e, per certi aspetti, anche il quadro clinico (9) quindi l’identificazione dei genotipi presenti in un apiario o in un territorio assume un’importanza pratica non secondaria. Le differenze fenotipiche più significative riguardano la morfologia delle colonie (3, 7).
In Germania, Svezia, Finlandia e Austria è stata dimostrata la presenza dei genotipi ERIC I e ERIC II (3, 6, 8) negli altri Paesi europei non esistono dati relativi ai genotipi circolanti.
Scopo del nostro lavoro è stato quello di sottoporre a genotipizzazione e a caratterizzazione biochimica ceppi di P.larvae isolati nel corso del 2010 al fine di acquisire informazioni sui genotipi ERIC presenti nel nostro territorio.
MATERIALI E METODI
Sono stati esaminati 20 ceppi di P.larvae isolati da detriti invernali (11 ceppi), da miele (1 ceppo) e da larve (8 ceppi) provenienti da singoli alveari di 18 apiari delle province di Modena, Bologna, Ravenna, Reggio Emilia e Brescia. L’identificazione di conferma è stata eseguita in PCR (2). I ceppi sono stati selezionati sulla base della diversa morfologia delle colonie nelle piastre di primo isolamento.
Esami biochimici
Per lo studio del profilo biochimico è stato impiegato il sistema API® 50 CH (BioMérieux) seguendo le indicazioni fornite dal produttore. Abbiamo esaminato colture di 24 ore. Per la semina delle gallerie è stata utilizzata una sospensione batterica in API® 50 CHB medium con densità pari al tubo 2 della scala Mc Farland. Le letture sono state fatte dopo 48 ore di incubazione in atmosfera arricchita con il 10% di CO2.
P.larvae mostra una scarsa attività fermentante. La lettura visiva delle prove in questi casi si presta a interpretazioni soggettive. Sono state considerate positive solo le prove in cui la reazione era nettamente positiva. Le fermentazioni deboli e parziali, che potevano portare a differenti interpretazioni del risultato, sono state considerate negative
Esami biomolecolari
Da colture batteriche di 24 ore il DNA è stato estratto secondo il protocollo descritto da Genersh et al. (3, 4). Per ciascun campione è stata condotta la PCR utilizzando la coppia di primers ERIC1R /ERIC2 in un volume finale di 25µl impiegando i reagenti e le condizioni di amplificazione descritte in bibliografia (3, 4). Cinque µl del prodotto di amplificazione sono stati analizzati in gel di agarosio al 0,8%. Le bande di DNA sono state colorate con Bromuro di Etidio e visualizzate mediante UV.
RISULTATI
In primo isolamento le colonie dei ceppi esaminati presentavano due diversi morfotipi. Al primo appartenevano colonie riferibili a tipiche colonie di P. larvae: colore bianco- grigiastro, a volte diafane e quasi trasparenti, superficie piatta, granulosa, asciutta o leggermente lucente, margine irregolare. Al secondo appartenevano colonie di aspetto ceroso, con superficie liscia, leggermente ombelicate, mai trasparenti, a margine, in genere, netto. Queste colonie presentavano spesso una pigmentazione arancione che poteva avere intensità variabile e diversa localizzazione.
In alcuni casi la pigmentazione era più intensa nella zona circolare esterna della colonia dove formava un anello ben evidente (pigmentazione “anulare”), in altri casi era presente solo in uno o più settori della colonia dove assumeva l’aspetto di un cuneo arancione con il vertice verso il centro della colonia e la base verso il margine esterno (pigmentazione “settoriale”). A volte le colonie, pur avendo la morfologia descritta, mostravano in primo isolamento un colore bianco cera ma nelle subcolture davano luogo a colonie pigmentate. La genotipizzazione mediante ERIC-PCR ha permesso di distinguere tutti i ceppi in esame come ERIC I o ERIC II secondo le specifiche riportate da Genersh et al. (3). In particolare erano visibili la banda di 970bp comune ai genotipi ERIC I e ERIC II ma mancante nei genotipi ERIC III e ERIC IV e la banda a 2800bp presente solo nel genotipo ERIC II (Figura 1).
I risultati degli esami eseguiti sono riassunti nelle tabelle 1 e 2. Sono stati riportati solo i risultati delle prove biochimiche che hanno mostrato un potere discriminante, escludendo quelle i cui risultati erano variabili all’interno dei due gruppi o che davano gli stessi risultati per i ceppi di entrambi i gruppi. La fermentazione del fruttosio, del mannosio e del mannitolo è risultata sempre positiva nei ceppi atipici pigmentati e negativa in quelli classici.
DISCUSSIONE
Viene dimostrata per la prima volta la presenza di P. larvae genotipo ERIC II nel nostro Paese.
La conoscenza delle caratteristiche morfologiche delle colonie di questo genotipo è di importanza fondamentale e la mancata conoscenza delle possibili varianti può portare ad errori diagnostici.
Esiste una correlazione tra la morfologia delle colonie e i risultati della tipizzazione genetica con ERIC primers; le colonie tipiche sono sempre risultate appartenere al genotipo ERIC I, quelle atipiche e pigmentate al genotipo ERIC II.
Si osserva inoltre la presenza di due distinti patterns metabolici. La fermentazione del fruttosio, del mannosio e del mannitolo sembra essere genotipo-specifica. A conclusioni analoghe erano giunti Neuendorf et al. (7 ) e Genersch et al. (3)
Ai due genotipi corrisponderebbero quindi due diversi biotipi. La fermentazione della salicina che in altri lavori risulta sempre positiva per il genotipo ERIC I e negativa per ERIC II (3) nel nostro caso ha dato esito negativo per tutti i ceppi in esame. Probabilmente ciò è imputabile al fatto che la fermentazione della salicina è spesso parziale e produce un debole viraggio cromatico dell’indicatore (3, 1) quindi un criterio di lettura severo come quello da noi applicato può portare a discordanze nella lettura del test.
BIBLIOGRAFIA
1. Carpana E., Marocchi L., Gelmini L. (1995). Evaluation of the API 50CHB system for the identification and biochemical characterization of Bacillus larvae. Apidologie 26, 11-16.
2. Bassi S., Carra E., Carpana E., Paganelli G.L., Pongolini S. (2010). A scientific note on the detection of spores of Paenibacillus larvae in naturally and artificially contaminated
honey: comparison of cultural and molecular methods. Apidologie 41, 425-427.
3. Genersch E., Forsgren E., Pentikäinen J., Ashiralieva A., Rauch S., S., Kilwinski J., Fries I. (2006). Reclassification of Paenibacillus arvae subsp. pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsp. larvae as Paenibacillus larvae without subspecies classification. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56, 501-511.
4. Genersch E., Otten C. (2003). The use of repetitive element PCR fingerprinting (rep-PCR) for genetic subtyping of German field isolates of Paenibacillus larvae subsp. larvae. Apidologie 34, 195–206.
5. Genersch E., Ashiralieva A., Fries I. (2005). Strain- and genotype-specific differences in virulence of Paenibacillus larvae subsp. larvae, a bacterial pathogen causing American foulbrood isease in honeybees. Appl. Environ. Microbiol. 71, 7551–7555.
6. Loncaric I., I. Derakhshifar J. T. Oberlerchner H. Ko¨glberger A., Moosbeckhofer R. (2009). Genetic diversity among isolates of Paenibacillus larvae from Austria. J. Invertebr. Pathol. 100, 44–46.
7. Neuendorf S., Hedtke K., Tangen G., Genersch E. (2004). Biochemical characterization of different genotypes of Paenibacillus larvae subsp. larvae, a honey bee bacteria pathogen. Microbiology 150, 2381–2390.
8. Pentikäinen J., Kalliainen E., Pelkonen S. (2009). Molecular epidemiology of Paenibacillus larvae infection in Finland. Apidologie 40, 73–81.
9. Rauch S., Ashiralieva A., Hedtke K., Genersch E. (2009). Negative correlation between individual-insect-level virulence and colony-level virulence of Paenibacillus larvae, the etiologica agent of American foulbrood of honeybees. Appl. Environ. Microbiol. 75, 3344–3347.
Tabella 1 - Risultati esami biochimici e biomolecolari dei ceppi con colonie a morfologia tipica.
N
Matrice
Pigmentazione Genot. ERIC
glucosio fruttosio mannosio mannitolo maltosio
saccarosio 4 Larve - 1 + - - - - - 5 Larve - 1 + - - - - - 6 Larve - 1 + - - - - - 9 Detriti - 1 + - - - - - 10 Detriti - 1 + - - - + - 12 Larve - 1 + - - - - - 13 Detriti - 1 + - - - - - 15 Detriti - 1 + - - - - - 17 Detriti - 1 + - - - - - 19 Larve - 1 + - - - - +
Tabella 2 - Risultati esami biochimici e biomolecolari dei ceppi con colonie a morfologia atipica
Matrice
Pigmentazione Genot. ERIC
glucosio fruttosio mannosio mannitolo maltosio
saccarosio 1 Larve + 2 + + + + - - 2 Larve + 2 + + + + - - 3 Miele + 2 - + + + - - 7 Detriti + 2 + + + + - - 8 Larve + 2 - + + + - - 11 Detriti + 2 - + + + - - 14 Detriti + 2 + + + + - - 16 Detriti + 2 + + + + - - 18 Detriti + 2 + + + + - - 20 Detriti + 2 + + + + - -
Si ringraziano i tecnici Roberta Giannasi, Marilena Abatematteo e Vanni Righetti per la collaborazione tecnica prestata.