Corrado F.**, De Roma A.**, Galiero G.**, Guarino A.**, Esposito M.**, Maglio P.**, Del Carlo M.*, Malascorta R.*, Compagnone D.*
*Dipartimento di Scienze degli Alimenti, Università degli Studi di Teramo ** Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno
Keywords: cefalopodi, metalli pesanti, voltammetria SWASV,
SUMMARY
The occurrence of toxic heavy metals in acquatic environment remains a severe problem because they can accumulate in fish and other organisms and require the safety assessment of food. The aim of this work is the validation of an electrochemical analytical protocol, based on SWASV, as screening method to detect heavy metals, namely Cd2+ and Pb2+, in different fish matrix and the application to real samples.
INTRODUZIONE
I metalli pesanti sono componenti naturali della crosta terrestre tuttavia varie attività antropogeniche possono causare la loro immissione nell’ambiente, provocando una diffusa contaminazione soprattutto del suolo e delle acque. Gli organismi che vivono negli ambienti acquatici possono tollerare una certa concentrazione di tali sostanze e, se non sono in grado di eliminarle, tendono ad accumularle in vari organi. Bioaccumulo e biomagnificazione sono i due fenomeni che determinano la presenza dei metalli nella catena alimentare e quindi nei prodotti ittici che costituiscono un alimento di grande consumo (1). Alcuni di questi metalli, come elementi in tracce (ad es. rame, selenio, zinco) sono essenziali per il metabolismo del corpo umano ma per altri è nota la loro tossicità anche in basse concentrazioni. In particolare, il piombo e il cadmio sono tra i più pericolosi contaminanti alimentari ed una loro assunzione eccessiva può causare gravi patologie epatiche, ossee, renali oltre l’insorgenza di neoplasie (2). Al fine di tutelare la salute dell’uomo, la Commissione Europea ha fissato, con il Reg. (CE) 1881/2066 e succ.mod., i tenori massimi per alcuni metalli in alimenti destinati al consumo umano. Sono stati altresì stabiliti dei piani di controllo sugli alimenti a vari livelli della filiera, dall’importazione alla distribuzione, in maniera da verificare il rispetto di questi limiti massimi e quindi garantire la salute dei consumatori.
La metodica analitica di riferimento per il dosaggio dei metalli pesanti è la Spettroscopia di Assorbimento Atomico (AAS). Tale tecnica richiede lunghi tempi di analisi, alti costi di acquisto e gestione della strumentazione e può causare perdite di analita per evaporazione dovuta all’elevata temperatura di esercizio. Per questo motivo, crescente attenzione è stata rivolta alla individuazione di nuovi metodi analitici per uno screening dei metalli pesanti, rapido e a basso costo.
In questo ambito, il presente lavoro ha riguardato la messa a punto di una tecnica elettrochimica, la Voltammetria Di Ridissoluzione Anodica ad Onda Quadra (Square Wave Anodic Stripping Voltammetry, SWASV) per l’analisi di tali inquinanti nei prodotti della pesca. Questa tecnica sfrutta la capacità di alcuni anioni metallici di formare sali insolubili con il materiale di cui é composto l’elettrodo di lavoro e si sviluppa in due fasi successive: la preconcentrazione
dell’analita sull’elettrodo e la successiva ridissoluzione (stripping) della specie accumulata. La ridissoluzione avviene mediante una scansione di potenziale durante la quale viene misurata la corrente. Tale tecnica consente di quantificare simultaneamente Cd (Il) e Pb (Il), con limiti di rivelabilità inferiori ai μg/l, e potrebbe essere utilizzata come valida alternativa all’assorbimento atomico. Nello specifico, le analisi sono state svolte su campioni di molluschi cefalopodi un prodotto caratterizzato da un elevato valore nutrizionale e tra le più apprezzate dalla nostra ristorazione.
MATERIALI E METODI
I reagenti e i solventi necessari per le analisi sono stati forniti da Carlo Erba Reagenti e Merck. Tutte le operazione sono state svolte senza mai utilizzare utensili in metallo. Le soluzioni di lavoro di cadmio e piombo sono state preparate al momento dell’uso. Per la verifica della validità del metodo, i campioni sono stati precedentemente analizzati con un metodo validato nel rispetto dei criteri previsti dal Regolamento (CE) 333/2007 e che utilizza l’assorbimento atomico, previa mineralizzazione mediante microonde.
Preparazione dei Campioni per analisi elettrochimica I campioni di pesce sono stati omogenati dopo aver eliminato le parti non edibili (testa, lisca, pinne, interiora, guscio, esoscheletro). 5 g del materiale sono stati trattati con 5 ml di H2O2 31%. La miscela è stata incubata a 50 °C per 2 h, poi sono stati aggiunti 5 ml di HCl 37% e la temperatura è stata aumentata a 70 °C per 2 h. La frazione liquida della miscela è stata filtrata su carta e purificata tramite una colonna SPE con 0,5 g di C18 come fase stazionaria. La colonna è stata prima condizionata con 2 ml di metanolo e 2 ml di acqua e successivamente caricata con 3 ml dell’estratto del campione. Per garantire un recupero quantitativo degli analiti, la colonna è stata lavata con 3 ml di HCl 0,1M per due volte. I 3 eluati sono stati raccolti e utilizzati per l’analisi.
Per la validazione sono stati preparati campioni fortificati a tre livelli di concentrazione. Ad aliquote di 5 g di muscolo di un campione bianco sono stati aggiunti quindi 50 µl, 100 µl e 150 µl di una soluzione 50 ppm di Pb e Cd, per ottenere concentrazioni finali nel muscolo rispettivamente, di 0.5, 1.0 e 1.5 mg/kg.
Analisi elettrochimica
Per le analisi è stato utilizzato un potenziostato Autolab PGSTAT 12 (METROHM) con software GPES (General Purpose Electrochemical System) predisponendo un potenziale di condizionamento di -0.3 V per 60 sec, un potenziale di deposito di -1.1 V per 600 sec, un’ampiezza di onda quadra di 28 mV ed un potenziale di accumulo di 3 mV a 15 Hz. L’analisi è stata condotta seguendo il metodo previsto da Meucci (3), depositando su un elettrodo del tipo “screen printed” 100 ml di una soluzione 80 ppm di cloruro
di mercurio in HCl 0.1M, e applicando un potenziale di –1.1 V per 5 min. Ciò ha permesso la riduzione del mercurio, che passando dallo stato di ossidazione 2+ a 0, si deposita sulla superficie dell’elettrodo. Quest’ultimo è stato quindi lavato con una soluzione HCl 0.1M per 2 min. a –0.2 V e poi sono stati caricati 100ml della soluzione contenente gli analiti. A questo punto è stato applicato un potenziale di –1.1 V che ha permesso la riduzione degli analiti e la loro deposizione sul mercurio, formando un amalgama. In questo modo, durante la scansione SQW, gli analiti depositatisi scaricano, generando dei picchi di ossidazione. La posizione dei picchi ha permesso la discriminazione della specie metallica e la loro altezza ha invece fornito informazioni relative alla loro quantità.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Per la validazione di un nuovo metodo si è proceduto prima alla determinazione del contenuto di Pb e Cd totale mediante spettrofotometria di assorbimento atomico con fornetto di grafite. Questa analisi ha previsto la mineralizzazione dei campioni, eseguita per via umida, mediante forno a microonde. La sperimentazione è stata effettuata su dodici diversi campioni tra cefalopodi, di cui 6 calamari, 2 totani, 2 polpi, 1 seppia e 1 mazzancolla prelevati sul mercato in esecuzione di controlli ufficiali. È stata condotta prima l’analisi del bianco, consistente nella lettura della soluzione tampone (HCl 0.1M) e ripetuta più volte allo scopo di verificare l’assenza di contaminazioni sia sull’elettrodo che nella soluzione stessa. Successivamente sono state analizzate soluzioni a differenti concentrazioni, con tempi di deposizione diversi, prima del piombo, poi del cadmio, e infine soluzioni miste, derivando le relative calibrazioni.
Figura 1 Voltammogramma di una soluzione 100 ppb mista Pb/Cd a tre tempi di deposizione (60, 300 e 600s)
A questo punto sono stati analizzati i campioni mineralizzati, per i quali è stata verificata l’assenza di interferenti ai potenziali di interesse ma, eccetto il campione S12, non è stato possibile ottenere un segnale sufficientemente sensibile.
Al contrario, migliori risultati sono stati ottenuti svolgendo l’analisi dei campioni non pretrattati, utilizzando per l’estrazione dei metalli non la mineralizzazione, ma la tecnica della digestione e successiva purificazione mediante colonne SPE. E’ stata ottenuta una risposta lineare sia per il piombo che per il cadmio e la scarica a diversi potenziali ha reso possibile la loro discriminazione (Pb2+ a – 0.75V, Cd2+ a –0.55V). E’ stata poi svolta l’analisi a diversi tempi di deposizione e una calibrazione della matrice utilizzando un gruppo di campioni nell’intervallo di concentrazione di 50-250 ng/ml.
In Tabella 1 sono riportati i risultati dei 12 campioni, analizzati sia con AAS che con metodi elettrochimici.
Tabella 1. Confronto dei risultati ottenuti in SWASV vs AAS Cd mg/kg Cd mg/kg Pb mg/kg Pb mg/kg AAS EC AAS EC S1 0.059 0.106 0.016 0.016 S2 0.188 0.170 0.036 0.040 S3 0.006 <lod 0.050 0.017 S4 0.021 <lod 0.023 0.015 S5 0.462 0.397 0.019 0.029 S6 0.010 <lod <0.020 0.017 S7 0.171 0.099 0.315 0.020 S8 0.073 0.099 <0.020 0.018 S9 <0.005 <lod 0.041 0.018 S10 0.008 <lod 0.020 0.034 S11 0.453 0.793 0.026 0.032 S12 2.000 2.370 0.085 0.063
* lod= limite di rilevabilità
Dai risultati ottenuti si può notare che, sia per il Cd che per il Pb, si ottengono picchi rilevabili per campioni che in partenza avevano una contaminazione di almeno 0.080 mg/ kg. In generale è emersa una soddisfacente correlazione fra i risultati ottenuti con entrambi i metodi, osservando in alcuni casi una leggera sottostima con il metodo elettrochimico. Tutti i campioni, tranne S12 per il Cd, erano sotto il livello massimo (1.0 mg/Kg) per entrambi i metalli, definito nel Regolamento (CE) 1881/2006.
CONCLUSIONI
Il metodo proposto per la determinazione di Cd e Pb in cefalopodi si è rivelato un valido sistema di screening qualitativo. Infatti i due metalli sono rintracciabili al LM, risultano ben discriminati e non si rilevano interferenze da parte della matrice. Il recupero dei metalli nelle soluzioni standard dopo il passaggio in colonne SPE è soddisfacente, perchè le soluzioni non si arricchiscono né perdono analita.
Sviluppi futuri riguardano un ulteriore lavoro di ottimizzazione della fase di digestione/purificazione del campione, necessario per rendere il metodo utilizzabile anche come screening quantitativo. L’analisi di campioni reali, già svolta con il metodo di riferimento in AAS, ha dimostrato che il metodo proposto consente di determinare la presenza dei contaminanti ai livelli di concentrazione realmente presenti, sebbene non sempre si ottengono valori accurati da un punto di vista quantitativo.
BIBLIOGRAFIA
1) Chapman P., Rhomberg G., Vigers G., Water J., (1982) Design of monitoring studies for priority pollutants, J.Water Pollut. Control Fed.; 54: 292-297.
2) Rojas E, Herrera LA, Poirier LA, Ostrosky-Wegman P., (1999) Are metals dietary carcinogens?, Mutat Res.;443(1- 2):157-81.
3) Meucci V. , Laschi S, Minunni M., Pretti C., Intorre L. , Soldani G., Mascini M., (2009) An optimazed digestion method coupled to electrochemical sensor for the determination of Cd, Cu, Pb, and Hg in fish by square wave anodic stripping voltammetry Talanta;77(3):1143-8.