Marchesani G., Mangiacotti M., Floridi F., Siragusa G., Chiaravalle A. E.
Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca della Radioattività nel Settore Zootecnico-Veterinario, IZS Puglia e Basilicata, Foggia;
Key words: Food irradiation, official check.
ABSTRACT – Food irradiation can be used to increase the microbiological safety and to extend the shelf life of foods. Community legislation states that any food or food ingredients must be labelled and that every year each Member State, particularly Italy, has to carry out checks at marketing stage. This work reports the results of analytical controls on 413 foodstuff samples over the period 2006-2011 and analysed with 4 different screening and confirmatory techniques: PSL, DNA Comet Assay, TL and ESR.
INTRODUZIONE – Le radiazioni ionizzanti (raggi gamma, raggi X e fasci di elettroni) sono utilizzate in campo alimentare per diversi scopi: ridurre la contaminazione di microrganismi alteranti, putrefattivi e soprattutto patogeni, devitalizzare eventuali parassiti, inibire la germogliazione in alcuni vegetali e aumentare la shelf-life dell’alimento, mantenendo pressoché inalterata la qualità organolettica e nutrizionale del prodotto di partenza. Pur essendo una tecnologia con indiscusse potenzialità, la food irradiation è al centro di numerose controversie dovute per lo più alla diffidenza dei consumatori che, essendo disinformati, sono intimoriti dalla terminologia utilizzata e temono rischi per la propria salute. I numerosi studi finora condotti hanno confermato l’assenza di effetti nocivi sugli alimenti trattati con tale tecnologia, determinando solamente in pochi casi e per un ristretto numero di tipologie alimentari, una ridotta perdita di alcune vitamine, paragonabile a quella ottenuta con altre tecnologie più diffuse quali ad es. i trattamenti termici. Il quadro normativo europeo che regola l’intero settore differisce da quello internazionale, molto meno restrittivo, e comprende due Direttive Comunitarie (1999/2/CE e 1999/3/ CE) che l’Italia ha recepito con il D.Lgs. n° 94 del 30/01/01 (1). In tali direttive viene specificato che il limite massimo a cui gli alimenti possono essere irraggiati è di 10 kGy e che il trattamento deve essere riportato in etichetta con la dicitura “irradiato” o “trattato con radiazioni ionizzanti”. L’unica categoria alimentare, presente in una lista positiva ed autorizzata a circolare liberamente sul mercato di ciascuno Stato Membro, è costituita da erbe aromatiche essiccate, spezie e condimenti vegetali, mentre altre tipologie di alimenti possono essere irraggiate solo se autorizzate a livello nazionale. Il regolamento prevede anche che ciascuno Stato Membro effettui controlli sugli impianti d’irraggiamento e sugli alimenti presenti in fase di commercializzazione sia in forma sfusa che confezionata. A tal proposito i laboratori dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata, hanno validato e accreditato tutti i metodi normati di tipo fisico, sia di screening (Luminescenza fotostimolata - PSL) che di conferma (Risonanza Elettronica di Spin - ESR, Termoluminescenza - TL) unitamente al metodo di screening di tipo biologico (DNA Comet Assay) per l’identificazione di alimenti o ingredienti trattati con radiazioni ionizzanti. In questo lavoro verranno presentati i risultati dei controlli effettuati su matrici alimentari sia di origine animale che vegetale presenti sul mercato italiano e di importazione, relativi al periodo dicembre 2006 - agosto 2011.
MATERIALI E METODI – Elemento essenziale per effettuare i piani di controllo ufficiale sulla presenza di prodotti trattati con radiazioni ionizzanti sui mercati nazionali è la fase del campionamento. Per garantire la corretta rappresentatività ed omogeneità di ciascun campione sono stati coinvolti gli organi di prelievo ufficiali distribuiti sull’intero territorio nazionale (Uffici Periferici del Ministero della Salute ed Organi del Servizio Sanitario Nazionale) a cui sono state trasmesse tutte le istruzioni e le informazioni riguardanti le modalità di prelievo. Tali indicazioni sono state fornite dall’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata e riguardano: quantità di campione per ogni singola aliquota sufficiente ad eseguire l’analisi, modalità di conservazione e di trasporto avendo cura di tenere il campione al riparo da fonti luminose e/o di calore per le matrici da analizzare con tecniche di luminescenza (PSL e TL) ed, infine, eventuali informazioni riportate in etichetta con particolare riferimento alla provenienza ed alla classificazione del prodotto in esame. I piani di controllo sono stati effettuati utilizzando i metodi di screening e di conferma riportati in tabella 1 con i relativi campi di applicazione. Le tecniche di luminescenza, PSL e TL, prevedono l’utilizzo di una stimolazione ottica e termica rispettivamente, sui minerali silicati presenti come contaminanti nei campioni. La tecnica del DNA Comet Assay prevede una corsa elettroforetica su gel di agarosio di singole cellule estratte da tessuto animale o vegetale, seguita da un’analisi dell’immagine con microscopio in epifluorescenza. La risonanza elettronica di spin (ESR), invece, prevede la determinazione di specie radicaliche stabili radio-indotte specifiche in matrici contenenti ossa, cellulosa o zucchero cristallino.
Tabella 1 – Standard e rispettivi campi di applicazione utilizzati
nei controlli effettuati negli anni 2006-2011.
STANDARD TECNICA METODO Campo di applicazione
EN 13784/2001 DNA Comet (2) Assay
SCREENING Carne, semi, frutta secca e spezie EN 13751:2009 PSL (3) SCREENING Erbe e spezie, molluschi e crostacei EN 1788:2001 TL (4) CONFERMA Erbe, spezie, gamberetti, patate, frutta e vegetali
EN 1786:1996 ESR (5) CONFERMA Alimenti contenenti
ossa
EN 1787:2000 ESR (6) CONFERMA Alimenti contenenti
cellulosa
EN 13708/2001 ESR (7) CONFERMA Alimenti contenenti
La strumentazione in dotazione comprende: un lettore di luminesenza fotostimolata della SURRC; un lettore di termoluminescenza della Riso - TL/OSL Reader Mod. DA- 20; un microscopio ad epifluorescenza della Optica Mod. B-350; uno spettrometro di risonanaza elettronica di spin della Bruker Mod. EMX-113 ed un irraggiatore a raggi X della Rad Source Mod. RS-2400. Tutte le procedure di analisi utilizzate sono state effettuate da personale altamente qualificato ed includono programmi di assicurazione della qualità, previsti dalla ISO EN 17025:2005, quali: conferma metrologica, controlli di qualità interni e partecipazione a circuiti di inter-confronto. I campioni analizzati sono stati divisi in 6 categorie: prodotti carnei (P.C.); prodotti ittici (P.I.); erbe, spezie e condimenti (E.S.C.); frutta (F); vegetali (V); altro (A). Il protocollo di analisi ha previsto l’uso del DNA Comet Assay come screening e dell’ESR come conferma per i campioni appartenenti alla categoria prodotti carnei (anche se tale protocollo è stato applicato per i controlli ufficiali solo nel 2011), mentre per la maggior parte dei campioni della categoria P.I. e E.S.C. è stata utilizzata la combinazione PSL come screening e TL come conferma. E’ opportuno ricordare che non tutte le tipologie di prodotti, come ad esempio frutta, polpi, calamari etc possono essere analizzate con le tecniche di screening perché privi di marker specifici dell’irraggiamento o di requisiti specifici richiesti dai metodi ufficiali.
RISULTATI E DISCUSSIONE – Le informazioni relative al numero di campioni ed analisi suddivise per anno e per tipo di metodica utilizzata sono riportate in tabella 2. Il n° di campioni totali pervenuti nel periodo preso in considerazione è di 413, mentre il n° di analisi effettuate è di 438, includendo quelle indagini con risultati intermedi o positivi allo screening. Tabella 2 – Numero di campioni ed analisi suddivise per anno e per metodica utilizzata
Il n° complessivo di analisi relative ai controlli nel periodo dicembre 2006 – agosto 2011 presenta un trend in crescita con l’incremento maggiore registrato nell’anno 2011. Anche il numero e l’applicazione delle diverse metodologie sono aumentati nel corso degli anni passando dall’utilizzo della sola tecnica ESR nel 2006 all’attuale impiego di ben 4 tecniche di cui 2 metodi di screening (DNA Comet Assay – PSL) e 4 metodi di conferma (ESR – TL), sufficienti per l’identificazione del trattamento radiante sulla quasi totalità delle tipologie alimentari presenti in commercio. Il 50 % delle analisi effettuate è stato eseguito con la PSL, seguita dall’ESR e dalla TL, mentre solo pochi campioni sono stati analizzati in DNA Comet Assay, in quanto tale metodologia è stata di recente validata e accreditata. I risultati ottenuti confermano che la PSL è una metodologia versatile e
idonea per lo screening di numerose matrici alimentari. In figura 1 è riportato un grafico con le percentuali delle analisi suddivise per ciascuna categoria alimentare. Il 37% delle analisi effettuate riguarda la categoria dei prodotti ittici che comprende principalmente molluschi, crostacei e pesci; il 21% riguarda i prodotti carnei che includono: carne di pollo, manzo, maiale, cosce di rana, etc. contenenti osso; il 26% riguarda la categoria erbe, spezie e condimenti rappresentata da: aglio, cipolla, peperoncino, origano, pepe, condimenti o insaporitori vari, etc.; il 7% riguarda la frutta fresca quale mango, papaya, banane, fragole, nespole, etc. e quella secca con guscio quale pistacchi, noci, mandorle etc.; l’ 8% riguarda i vegetali costituiti soprattutto da patate e funghi, inclusi alcuni campioni di grano; ed infine l’1% della categoria “altro” include un campione di tofu, un integratore salino ed un campione di zucchero marrone. La frutta secca con gusci, le fragole e tutti i campioni appartenenti alla categoria prodotti carnei sono stati analizzati in ESR, eccetto 17 campioni analizzati con DNA Comet Assay, mentre tutti i campioni di frutta fresca sono stati analizzati in TL. In generale la scelta del metodo idoneo per l’analisi dei restanti campioni dipende, per ciascuna metodica, principalmente dalla tipologia alimentare e dal campo di applicazione. Circa l’8% dei campioni analizzati in PSL ha dato risultati non interpretabili o falsi positivi, analizzati successivamente con le opportune tecniche di conferma. Tutti i 17 campioni analizzati con la tecnica del DNA Comet Assay sono stati correttamente identificati e l’assenza di falsi positivi o risultati dubbi è, con molta probabilità, da attribuire alla esigua quantità di campioni ufficiali finora eseguiti. Figura 1 – Percentuale di campioni analizzati dal 2006 al 2011 distinti in base alla categoria di appartenenza.
Dall’analisi dei dati si evince che su un n° totale di 15 campioni risultati non conformi, di cui solo 2 campioni su un totale di 75 (2,7 %) sono stati rilevati nel 2010, mentre ben 13 campioni su un totale di 285 (4,6 %) sono risultati positivi nel 2011, anno in cui il numero delle analisi è considerevolmente aumentato. Le tipologie di matrici che sono risultate non conformi sono: 6 campioni di cosce di rana provenienti dalla Francia e dal Vietnam; 3 campioni di vongole, 2 campioni di seppie e 1 campione di gamberi provenienti dal Vietnam; 1 campione di calamari e 1 campione di tofu provenienti dalla Cina ed 1 campione di coriandolo proveniente dall’Ucraina. In particolare i campioni di vongole, il tofu (contenente peperoncino), il coriandolo ed i gamberi sono stati analizzati sia in screening (PSL) che in conferma (TL). In seguito alle comunicazioni di positività,
il Ministero della Salute ha attivato numerose procedure di allerta comunitaria (RASFF - Rapid Alert System for Food and Feed) relative alle tipologie di campioni risultati non conformi. In conclusione dall’elaborazione dei risultati dei controlli effettuati per l’identificazione di alimenti o ingredienti trattati con radiazioni ionizzanti, emerge la necessità di indirizzare i campionamenti principalmente sulle tipologie di prodotti già risultati positivi o provenienti da Paesi in cui sono attivi numerosi impianti di irraggiamento; e questo non per creare allarmismi ingiustificati, ma per consentire al consumatore la possibilità e il diritto di scelta.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
1) D. L.vo n° 94 del 30 gennaio 2001, G.U. n° 79 del 4 aprile 2001.
2) UNI EN 13784:2001 – Ricerca di alimenti irraggiati con
tecnica di DNA Comet Assay.
3) UNI EN 13751:2009 - Ricerca di alimenti irraggiati con l’utilizzo di luminescenza fotostimolata (PSL).
4) UNI EN 1788:2001 – Ricerca per termoluminescenza di alimenti irraggiati dai quali possono essere isolati i minerali silicati.
5) UNI EN 1786:1997 - Ricerca di alimenti irraggiati contenenti ossa. Metodo per spettroscopia di risonanza elettronica di spin (ESR).
6) UNI EN 1787:2000 – Ricerca di alimenti irraggiati contenenti cellulosa mediante spettroscopia di risonanza elettronica di spin (ESR).
7) UNI EN 13708:2001 – Ricerca di alimenti irraggiati contenenti zucchero cristallino mediante spettroscopia di risonanza elettronica di spin (ESR).
ANALISI FILOGENETICA ED EVOLUZIONISTICA DEI CEPPI INFLUENZALI SUINI H1N2 IN ITALIA
Moreno A., Sozzi E., Lelli D., Foni E., Chiapponi C., Fontana R., Alborali L., Cordioli P.Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna (IZSLER), Brescia
Key words: influenza suina, sottotipo H1N2, caratterizzazione molecolare
SUMMARY
We investigated the genomic evolution of the H1N2 subtype in Italy since the first isolation in 1998 to 2010. During this period, 66 H1N2 SIVs were detected and partially sequenced. For a deeper examination 26 strains were selected. Phylogenetic analysis of HA and NA genes showed differences between the older (1998-2003) and the more recent strains (2003-2010). The older isolates were closely related to the established European H1N2 lineage, whereas the more recent isolates showed a different NA deriving from human H3N2 viruses of 1997. Moreover two atypical strains have also been detected. These results showed the presence and establishement of reassortant strains involving human viruses in pigs in Italy.
INTRODUZIONE
I virus influenzali tipo A sono diffusi in molte specie animali tra cui volatili, suini ed uomo. Nel suino sono diffusi tre sottotipi H1N1, H3N2 ed H1N2. Il sottotipo H1N2, isolato per la prima volta in Gran Bretagna nel 1994 e successivamente in Italia nel 1998, deriva dal riassortimento genetico tra tre differenti virus influenzali. Possiede, infatti, la emoagglutinina (HA) di un virus H1N1 umano circolante nei primi anni ‘80, la neuraminidasi (NA) di un virus H3N2 di origine umana ed i sei geni interni dei virus H1N1 e H3N2 europei di origine aviare (1). Lo scambio di geni virali tra diversi virus influenzali attraverso fenomeni di riassortimento è un evento frequentemente riportato nella specie suina. In questa specie è stata infatti dimostrata la presenza di recettori NeuAc 2,3 Gal e 2,6 Gal caratteristici di virus influenzali aviari ed umani. Per questo motivo, è stato ipotizzato il ruolo del suino come mixing vessel e, recentemente, è stato identificato come reservoir di virus con potenziale pandemico (7). Lo scopo del presente lavoro riguarda l’analisi filogenetica e molecolare di 26 ceppi H1N2 isolati in Italia dal 1998 al 2010 attraverso il sequenziamento completo dei geni HA e NA, il confronto con le sequenze di ceppi influenzali suini (SIV), umani ed aviari (AIV) presenti in banca dati ed il calcolo dell’antenato comune più recente (tMRCA). L’analisi filogenetica è stata eseguita allo scopo di verificare le relazioni genetiche fra virus influenzali appartenenti allo stesso sottotipo o a sottotipi differenti, per meglio comprendere l’importanza della continua evoluzione e la comparsa di possibili fenomeni riassortanti.
MATERIALI E METODI
Campionamento
Nel periodo compreso tra il 1998 ed il 2010, sono state eseguite indagini virologiche su tamponi nasali e polmoni di suini con sintomi clinici e lesioni anatomopatologiche riferibili a malattia respiratoria acuta.
Virus
I ceppi utilizzati in questo studio sono stati isolati su uova embrionate di pollo e/o su linee cellulari MDCK e Caco-2. La determinazione del sottotipo virale è stata infine eseguita con l’utilizzo di due multiplex RT-PCR per la determinazione della H e della N (2).
Sequenziamento ed analisi filogenetica
La caratterizzazione molecolare dei ceppi H1N2 è stata eseguita attraverso il sequenziamento parziale dei geni HA e NA di 66 ceppi e completo di 26 ceppi selezionati (3). Le sequenze ottenute sono state analizzate in BLAST e confrontate con quelle di ceppi di riferimento ottenute in GenBank mediante allineamento con CLUSTAL W. L’albero filogenetico è stato costruito con il programma MEGA 5 utilizzando il metodo maximun likelihood, modello Tamura Nei(8). Il calcolo del tMRCA è stato stimato mediante analisi Bayesiana con il metodo delle catene di Monte Carlo con il modello evolutivo GTR+G4 per la condizione di orologio stretto (9). La corsa è stata condotta per 50 milioni di catene campionando ogni 1000. L’albero è stato generato con il massimo prodotto della posterior probability dopo un burnin del 10%. Sui geni HA e NA è stata inoltre eseguita una stima del tasso di sostituzione sinonimo e non sinonimo (dN/dS). Sono stati preparati 3 set di dati (European SIV H1human-like, European SIV H1 avian- like, European SIV N2) con le sequenze dei ceppi italiani e di riferimento ottenute da NCBI Influenza Virus Resource. Sono state prese in considerazione solo sequenze codificanti le proteine complete. Per ogni data set il rapporto dN/dS è stato calcolato utilizzando il metodo Fixed Effects Likelihood (FEL) disponibile in Datamonkey online version (Hy-Phy package) (4).
RISULTATI
Nel periodo 1998-2010 sono stati isolati e caratterizzati 66 virus influenzali H1N2. Di questi 26 sono stati scelti per una analisi filogenetica approfondita. L’albero filogenetico delle sequenze del gene HA ha evidenziato che i ceppi H1N2 (human-like) formano un cluster derivato dai ceppi umani H1N1 circolanti negli anni ’80 e chiaramente distinguibile dai ceppi H1N1 (avian-like). I ceppi isolati in Italia negli anni 1998-2003 presentano un’elevata omologia con i ceppi H1N2 europei. I ceppi italiani recenti (2003-2010) formano un cluster separato dai “vecchi” ceppi precedentemente descritti
e probabilmente derivano da due ceppi isolati nel 1998 (A/ sw/It/1521/98 e A/sw/It/62/98). E’ da sottolineare anche la presenza di due ceppi H1N2 riassortanti (A/sw/It/22530/02 e A/ sw/It/58769/10), la cui HA presenta un’elevata percentuale di omologia con i ceppi suini H1N1.
L’analisi delle sequenze del gene NA ha dimostrato che i ceppi H1N2 “vecchi” sono altamente correlati con il ceppo capostipite H1N2 Scot/410440/94 e con tutti gli altri ceppi H1N2 isolati in Europa dal ‘98 fino al 2010. Un dato molto interessante inoltre riguarda i ceppi recenti che presentano una N2 chiaramente distinta dai ceppi H1N2 suini europei. Questi ceppi clusterizzano con i ceppi H3N2 umani, isolati nella stagione 1997; la maggiore percentuale di omologia infatti si presenta con il ceppo A/HK/CUHK20199/97 isolato nel 1997 (95,1- 97,1%). Solo uno dei ceppi isolati di recente (A/sw/It/58769/10) possiede una NA diversa dai precedenti, altamente correlata con i ceppi SIV H3N2. E’ da sottolineare in particolare l’elevata omologia di questo ceppo sia per il gene HA che NA con due ceppi H1N2 isolati in Svezia (6).
La stima della divergenza temporale per il gene HA indica che i ceppi italiani recenti si sono probabilmente evoluti da un antenato comune, correlato con i ceppi 62/98 e 1521/98, che circolava nella popolazione suina tra la fine degli anni 90 e l’inizio del 2000. Per quanto riguarda il gene NA dei ceppi italiani sono state evidenziate due linee evolutive differenti: una per i vecchi ceppi il cui antenato risale a inizio anni novanta ed un’altra per i ceppi recenti che probabilmente derivano da un antenato comune che circolava nella popolazione suina agli inizi del 2000. E’ stato inoltre evidenziato un maggior tasso di variazione genica per il gene NA rispetto il gene HA, espresso come sostituzioni per sito per anno rispettivamente 28 x 10-3 (3,04-3,52 95%HPD) e 2,90 x 10-3 (2,69-3,12 95%HPD). I valori del rapporto dN/dS, stimati per ogni set di dati, sono risultai 0,166 per H1 avian like, 0,234 per H1 human like e 0,177 per N2. Malgrado il valore più elevato sia stato evidenziato per la H1 human-like, soltanto nella H1 avian-like sono stati individuati degli aa sottoposti a pressione selettiva positiva nelle posizioni 11, 159, 338.
DISCUSSIONE
Il sottotipo H1N2 è stato l’ultimo a stabilirsi nella popolazione suina europea ed in particolare in Italia dal 1998. Negli anni 1998-2003, il numero di ceppi italiani H1N2 è risultato molto basso (3%) con addirittura nessun isolato nell’anno 2004. Dal 2005 invece la loro frequenza si è incrementata notevolmente essendo negli ultimi 2 anni il sottotipo più frequentemente isolato (37%) rispetto al H1N1 (35%) ed al H3N2 (28%). Studi evolutivi recenti condotti sui ceppi suini H1N2 europei (4) hanno ipotizzato che il genotipo H1N2 in Europa si sarebbe formato a partire da un ceppo precursore dotato di una NA di derivazione umana. Questo precursore avrebbe incorporato in seguito la HA da ceppi H1N1 umani. Questi dati risultano in linea con quanto evidenziato nel presente studio. Sembrerebbe quindi che i ceppi precursori H1N2 abbiano circolato nel territorio europeo per alcuni anni prima della identificazione del primo isolato nel 1994 in Scozia. Molteplici fenomeni di riassortimento sono stati ipotizzati nella evoluzione di questi virus. In particolare si segnala la presenza di tre ceppi H1N2 riassortanti caratterizzati da una HA derivante dai ceppi
SIV H1N1: un ceppo (Sw/It/2064/99) previamente descritto (5) ed altri due sw/It/22530/02 e sw/it/58769/10 sequenziati nel presente lavoro. Quest’ultimo ceppo possiede anche la NA altamente correlata con i ceppi SIV H3N2. Questi eventi confermano la frequenza di fenomeni di riassortimento tra ceppi suini dei diversi sottotipi tuttavia questi nuovi ceppi riassortanti non sembrano essere completamente adattati in quanto non si sono diffusi nella popolazione suina. Notevole interesse rivestono i ceppi italiani H1N2 recenti (2003-2010) che probabilmente derivano da un reassortimento tra i ceppi H1N2 suini ed i ceppi H3N2 umani. Nel 2003 sono stati isolati solo 2 ceppi H1N2 ma soltanto uno con queste caratteristiche. Dal 2005 dopo un anno senza nessun isolamento tutti i ceppi H1N2 isolati nel nostro Istituto tranne 1 possiedono invece la NA derivata dai ceppi umani H3N2. A differenza dei ceppi riassortanti evidenziati precedentemente, questi nuovi ceppi sembrerebbero essere maggiormente adattati alla popolazione suina e rappresentano la totalità dei ceppi H1N2 isolati in questi ultimi anni. L’analisi evolutiva condotta ha rilevato infatti due linee evolutive diverse per i ceppi italiani. I ceppi vecchi altamente correlati con i ceppi suini europei H1N2 ed i nuovi derivati da un antenato comune che probabilmente avrebbe incorporato una NA derivata dai virus H3N2 umani del 1997 più o meno nell’anno 2000. Segnalazioni di ceppi simili non