Pozzi F.1, Vezzoli F.1, Nassuato C.2, Franco A.3, Ianzano A.3, Battisti A.3, Luini M.1
1IZSLER - Sezione di Lodi, 2IZSLER – Sorveglianza Epidemiologica Lombardia, 3IZSLT – CRN per l’Antibioticoresistenza
Key Words: S. aureus, bovino, MRSA
SUMMARY
MRSA were recently detected in bovine milk in several European countries. The aim of this study was to evaluate the prevalence of S. aureus and MRSA (meticillin-resistant Staphylococcus aureus) in the bulk tank milk of dairy cattle of an area of the Po Valley. We analyzed samples from 311 farms and 95 were positive for S. aureus (30,5%). In our study 26% of farms produced milk with low levels of S. aureus (<50 UFC/ml), while high levels (> 400 UFC/ml) are reported in 36% of cases. 15 samples were positive for MRSA (4.8%) and two of them were grouped within the Clonal Complex 398.
INTRODUZIONE
MRSA (Meticillin Resistant Staphylococcus Aureus) è emerso come problema negli anni ‘70 negli USA ed è diventato un problema mondiale come responsabile di episodi di infezione nosocomiale (Hospital Acquired MRSA, HA-MRSA), ma anche in soggetti sani, senza una correlazione epidemiologica con il ricovero ospedaliero (Community Associated MRSA, CA-MRSA). Ricerche effettuate negli ultimi anni hanno evidenziato che ceppi di MRSA possono essere responsabili di infezioni in varie specie di animali da compagnia e d’allevamento (suini, bovini, ovini, specie aviarie, equini) e sembrano aver trovato, nella specie suina in particolare, un reservoir di particolare rilevanza per la presenza di ceppi appartenenti al complesso clonale CC398, il principale tra i Livestock Associated MRSA (LA-MRSA). Questi agenti sono in grado di colonizzare attivamente e produrre infezione anche negli gli esseri umani e pertanto LA-MRSA è a tutti gli effetti un agente zoonosico emergente, specialmente in alcune categorie professionali (allevatori e relativi familiari, personale di allevamenti e macelli, veterinari) (4,10). Anche matrici alimentari, come per esempio vari tipi di formaggio e carni, sono risultate contaminate da MRSA e vanno tenute in considerazione nella trasmissione all’uomo (5,9). Studi effettuati su campioni di latte mastitico in Belgio (12), in Germania (7) e in Italia (2) hanno portato all’isolamento di numerosi ceppi di MRSA, evidenziandone la presenza nel latte bovino e nei suoi derivati. I ceppi erano prevalentemente riferibili a ST398. Negli Stati Uniti nel corso di un’ampia indagine sul latte di massa il 3.2% dei campioni risultava positivo per il gene mecA, ma nessun ceppo di MRSA è stato isolato (11). Il presente lavoro descrive l’isolamento di S. aureus e la genotipizzazione di ceppi di MRSA dai campioni di latte di massa delle aziende bovine della Provincia di Lodi.
MATERIALI E METODI
Campioni – Sono stati analizzati campioni di latte di massa bovino provenienti da 311 sul totale delle 351 aziende da latte della Provincia di Lodi. Il prelievo è stato effettuato in contenitori sterili dopo agitazione e raffreddamento della massa a fine mungitura ed è stato conservato refrigerato a 4-7°C fino alla consegna al laboratorio.
Esami batteriologici – Prima della semina, i campioni sono stati tenuti per 1-2 ore a temperatura ambiente e agitati al fine di disperdere il grasso e gli eventuali microrganismi presenti. La semina è stata comunque effettuata entro 24 ore dal prelievo. Il latte
è stato seminato direttamente in quantità di 100 µl tal quale e della diluizione 1:10 su terreno Baird Parker - Rabbit Plasma Fibrinogen agar (BP-RPF). Dopo 48 ore di incubazione a 37°C, dai campioni di latte risultati positivi (sviluppo di colonie con caratteristico alone di opacamento per coagulazione del plasma) sono state scelte 4 o 5 colonie per conferma mediante test della coagulasi in provetta e crescita su Mannitol Salt Agar (MSA). Le colonie coagulasi positive e mannitolo positive sono state considerate S. aureus. Il conteggio delle colonie in UFC è stato effettuato con un calcolo della media ponderata delle due successive diluizioni.
Meticillino-resistenza – Analisi microbiologiche – Per ciascun campione, fino a 5 colonie riferibili a Staphylococcus aureus sono state sottoposte a screening per la meticillino-resistenza mediante test di sensibilità all’oxacillina secondo Kirby Bauer utilizzando dischetti da un 1 mcg. Per aloni di inibizione > a 12 mm i ceppi sono stati considerati sensibili, per aloni compresi fra 12 e 10 mm intermedi e ≤ di 10 mm resistenti. Analisi molecolari – Dai ceppi risultati resistenti o intermedi all’oxacillina è stato estratto il DNA utilizzando il kit “Dneasy Blood and Tissue” (Qiagen) e sucessivamente è stato amplificato mediante una reazione di multiplex PCR per l’identificazione simultanea dei geni nuc e mecA, utilizzando primers riportati in letteratura (3,8) e l’utilizzo di DNA polimerasi HotStarTaq (Qiagen). Il ciclo di amplificazione prevede una denaturazione iniziale a 95°C per 15 minuti, seguita da 30 cicli di 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 56°C e 1 minuto a 72°C e un’estensione finale a 72°C per 7 minuti.
Genotipizzazione – Gli isolati MRSA sono stati genotipizzati per MLST (Multi Locus Sequence Typing) secondo quanto riportato in letteratura (6).
RISULTATI
Esami batteriologici – Sul totale dei 311 campioni, 95 sono risultati positivi per S. aureus (30,5%; I.C. 95%: 28,7-32,5) ed i rimanenti 216 negativi (<10 UFC/ml). In particolare 25 presentavano una conta compresa fra 10 e 50 UFC/ml, 9 compresa fra 51 e 100, 13 compresa fra 101 e 200, 9 fra 201 e 400, 17 fra 401 e 800 e 17 una conta > 800 UFC/ml. In 5 campioni è stata dimostrata la presenza di S.aureus, ma non è stata eseguita la conta (Tabella 1).
Meticillino-resistenza – Utilizzando il metodo di diffusione in agar, sul totale dei 95 ceppi di Staphylococcus aureus isolati, 27 sono risultati resistenti (R) o intermedi (I) all’oxacillina. La multiplex PCR eseguita sui DNA estratti ha confermato in tutti la presenza del gene nuc e ha evidenziato 15 ceppi mecA positivi pari al 16% dei ceppi di S. aureus isolati ed al 4,8% (I.C. 95%: 4,0-5,8) dei campioni di latte di massa esaminati (Tabella1). La localizzazione nell’ambito dell’area geografica considerata delle aziende positive nel latte di massa per S. aureus e per MRSA è rappresentata nella figura 1. Caratterizzazione molecolare – Due isolati su 15 appartenevano al Complesso Clonale 398.
DISCUSSIONE
In questo lavoro si documenta la presenza di S. aureus in 93 campioni di latte di massa di altrettante aziende del territorio considerato (30,5%). Sugli stessi campioni è stata eseguita la conta
di S. aureus e questo dato si può considerare predittivo dei livelli di prevalenza di vacche con infezione mammaria presenti nella mandria (National Mastitis Council). La conta ha evidenziato che solo il 26% delle aziende presentava un livello basso (<50 UFC/ml) e quindi con infezione probabilmente sotto controllo, mentre nel 36% dei casi sono state rilevate cariche anche molto elevate (> 400 UFC/ ml), limite che suggerisce una probabile alta prevalenza di vacche infette.
MRSA sono stati isolati nel 4.8% dei campioni/aziende esaminati, una percentuale che appare di per sè rilevante, anche se non paragonabile a quella ottenuta in altre indagini sul latte di massa, salvo quella condotta negli USA, che non ha evidenziato MRSA nei 218 campioni positivi per S.aureus (11). Osservando le conte di S. aureus e i rispettivi isolamenti di MRSA, sembrerebbe che la presenza di MRSA non sia associata ad una conta di S. aureus elevata, espressione di una maggiore diffusione dell’infezione in azienda. La caratterizzazione genotipica ha consentito di individuare 2 isolati appartenenti al CC 398 ed i rimanenti (dati preliminari) raggruppabili per la maggior parte in complessi clonali associati a specie zootecniche, compresa quella bovina, e già segnalati in Italia (1). Al momento comunque non si dispone di informazioni sufficienti per ipotizzare maggiore o minore virulenza di MRSA rispetto ad MSSA nelle specie zootecniche.
Relativamente alla meticillino-resistenza degli isolati sarebbe da approfondire il meccanismo della resistenza microbiologica all’oxacillina dei ceppi mecA negativi.
Il nostro lavoro conferma le recenti indagini che indicano il bovino come serbatoio di MRSA anche in alcune aree del territorio italiano ad alta vocazione per l’allevamento bovino da latte, analogamente a quanto già osservato in altre aree d’Europa e sottolineano la particolare importanza che assume il controllo delle mastiti bovine causate da questi ceppi in funzione della possibile contaminazione del latte (vedi consumi di latte crudo al distributore) e dei prodotti lattierocaseari.
BIBLIOGRAFIA
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Campioni Meticillino-resistenza Sens. Oxacillina mecA + S. aureus UFC/ml N. S I R < 10 216 - - - - 10 - 50 25 19 0 6 5 51 - 100 9 4 1 4 3 101 - 200 13 7 0 6 2 201 - 400 9 6 0 3 2 401 – 800 17 13 0 4 1 > 800 17 15 1 1 1 nd 5 4 0 1 1 Totale 311 Totale positivi 95 (31%) 68 2 25 15 (4.8%)
Tabella 1 – Campioni di latte di massa esaminati, Conta Batterica di S. aureus e meticillino-resistenza (sensibilità all’Oxacillina e presenza del gene mecA).
Figura 1 – Localizzazione nel territorio delle aziende positive per S. aureus e per MRSA nel latte di massa.
Le ricerche sono state eseguite nell’ambito del Progetto Di Ricerca Corrente Ministero della Salute PRC2008/08-IZSLER.