Parisi A.1, Miccolupo A. 1, Latorre L. 1, Bilei S. 2, Cogoni M. P. 3, Costa A. 4, Santagada G. 1
1Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Puglia e della Basilicata - Foggia; 2Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e Toscana - Dip. Roma;
3Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna - Dip. Cagliari; 4Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia - Dip. Palermo;
Key words: L. monocytogenes, Multi-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis, MLVA
SUMMARY
In this survey Multi-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) has been standardized and used to study 280 L. monocytogenes isolates from human, and food sources. A total of 83 MLVA types were identified. LMV1 and 3 were the most discriminative loci with a DI of 79.5 and 79.1 %, respectively. The present study confirmed the high value of MLVA subtyping for studying the epidemiology of L. monocytogenes.
INTRODUZIONE
Listeria monocytogenes è l’agente causale della listeriosi, una malattia sporadica che colpisce soprattutto alcune categorie di popolazione ad elevato rischio. Nel 2008 l’incidenza in Europa è stata pari a 0.4 casi su 100.000 abitanti; l’Italia nel periodo 2005-09 ha registrato un significativo incremento dei casi clinici. Nonostante i bassi tassi di incidenza, l’interesse nei confronti di tale malattia è giustificato dall’elevato tasso di mortalità (20- 30%), infatti la listeriosi risulta una delle cause più frequenti di decesso connessa a malattie trasmesse da alimenti (1). L. monocytogenes è largamente diffusa nell’ambiente e negli alimenti sia di origine animale che vegetale, anche se la fonte alimentare è ritenuta la principale via di contagio per l’uomo. Negli ultimi anni le tecniche di caratterizzazione genetica, in particolar modo quelle basate sull’analisi delle sequenze del DNA (MLST, MLVST), hanno consentito di acquisire importanti informazioni relative alla organizzazione della popolazione di L. monocytogenes, identificando quattro distinte linee genetiche (3). Inoltre gli studi molecolari hanno permesso di osservare una diversa distribuzione dei profili genetici negli isolati clinici, alimentari ed ambientali. La linea genetica I è più frequentemente coinvolta negli episodi clinici rispetto alla linea genetica II che è più frequente negli isolati alimentari, mentre le linee genetiche III e IV sono state identificate solo recentemente e sono più diffuse negli animali ed in particolar modo nei ruminanti. Sebbene queste tecniche presentino indiscutibili vantaggi sia dal punto di vista informativo che dal punto di vista tecnico, esse hanno dei limiti legati alla complessità ed al costo di esecuzione che ne limitano l’applicazione estensiva in campo. In un recente lavoro abbiamo potuto dimostrare come la tecnica di Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP) riesca a fornire una informazione largamente sovrapponibile a MLST seppur con livelli di processività e di costi nettamente più vantaggiosi (4). Lo scopo di questo lavoro era la standardizzazione di un protocollo MLVA per lo studio dell’epidemiologia di L. monocytogenes e l’applicazione su 280 stipiti isolati da casi clinici e da fonti alimentari.
MATERIALI E METODI
Complessivamente sono stati esaminati un totale di 280 ceppi provenienti da casi clinici (n=67) e di isolamento alimentare (n=213). Gli isolati appartenevano ai seguenti sierotipi: 1/2a (n=108), 1/2b (n=43), 1/2c (n=67), 3a (n=6), 3b (n=2), 3c
(n=1), 4b/4e (n=50), 4c (n=2), 4d (n=1). Preliminarmente una selezione di 30 isolati rappresentativi delle principali linee genetiche venivano sottoposti ad uno screening utilizzando 13 diversi VNTR come precedentemente descritto (2, 6). Quindi si effettuava una selezione dei VNTR in funzione della riproducibilità, stabilità e capacità di discriminazione. Un totale di 6 VNTR veniva ottimizzato per l’amplificazione in due distinte multiplex-PCR, quindi i prodotti di reazione venivano diluiti e miscelati in una mix contenente formammide e Genescan 600 Liz come ladder di peso molecolare. Le corse elettroforetiche erano eseguite mediante 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). I dati venivano analizzati mediante GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems), i singoli alleli venivano normalizzati, importati in Bionumerics 6.5 (Applied Maths) ed utilizzati per l’analisi filogenetica mediante Minimum Spanning Tree (MST) (Fig. 1).
RISULTATI
Complessivamente sono stati identificati 83 differenti profili allelici (MLVA). I singoli VNTR mostravano valori di Discriminatory Index di Simpson variabili tra 52.4 e 79.5 (Tab. 1) con un numero variabile di alleli compreso tra 4 e 10. I profili MLVA presentavano una buona correlazione con la appartenenza degli stipiti ai singoli sierotipi ed alle principali linee genetiche. Locus Alleli n. DI (%) LMV1 8 79.5 3 10 79.1 LMV9 4 52.4 32 7 71.6 LMV6 6 60.8 15 7 71.1
Tab. 1 VNTR. Sono illustrati per ciascun locus il numero di alleli e il DI di Simpson (%).
DISCUSSIONE
Le nuove acquisizioni nel settore dell’epidemiologia molecolare di L. monocytogenes hanno consentito di formulare ipotesi circa l’organizzazione della popolazione di questo microrganismo, sulla sua evoluzione prettamente clonale che ha consentito la suddivisione di linee genetiche ben distinte, nonché sull’attitudine di certi genotipi a dare malattia nell’uomo o a colonizzare determinate nicchie ecologiche. La sierotipizzazione, che in passato ha rappresentato il sistema
classico di riferimento, presenta dei limiti dal momento che oltre il 95% degli stipiti isolati da casi di listeriosi nell’uomo o da fonti alimentari appartengono ai sierotipi 1/2a, 1/2b e 4b (5). Tra i 67 isolati umani inclusi in questo studio il sierotipo prevalente è risultato 1/2a (n=39) seguito da 4b/4e (n=23), 1/2b (n=4) e 1/2c (n=1). Negli ultimi anni, per la caratterizzazione genetica di L. monocytogenes, è stata utilizzata come metodo di routine la Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) anche se le difficoltà di riproducibilità di questa tecnica fanno ritenere che nel prossimo futuro i sistemi sequence-based (MLST, MLVST) rappresenteranno lo standard di riferimento. Purtroppo le problematiche legate alla complessità tecnica ed ai costi di esecuzione di queste ultime impongono la ricerca di sistemi diagnostici alternativi che siano allo stesso tempo rapidi, economici e facilmente standardizzabili. La tecnica di MLVA analizzata in questo studio riteniamo possa rappresentare un valido strumento diagnostico specialmente nello studio di situazioni epidemiologiche complesse, come possono essere gli stabilimenti di produzione, in cui spesso diverse popolazioni della stessa specie possono convivere e contaminare gli alimenti, ma soprattutto quando vi sia la necessità di collegare tra loro diversi episodi clinici o questi alle rispettive fonti di contaminazione. MLVA si distingue per la notevole processività e per i contenuti costi di esecuzione, peraltro la tecnica è facilmente standardizzabile e riproducibile tra i laboratori garantendo la possibilità di confrontare gli isolati con un sistema univoco di interpretazione. A conferma di risultati di studi precedenti, gli stipiti di isolamento umano analizzati si concentrano all’interno di alcuni genotipi, mentre numerosi genotipi di isolamento alimentare non sembrano essere associati ad alcun episodio clinico. Non meno interessante è l’evidenza che MLVA dimostra una notevole capacità di discriminazione, consentendo di identificare diversi profili per alcuni gruppi di isolati risultati identici mediante MLST e non correlati epidemiologicamente (dati non illustrati). La disponibilità di tecniche di caratterizzazione efficienti ed economiche, come MLVA, potrà migliorare la conoscenza dell’epidemiologia di questo importante patogeno, soprattutto attraverso la condivisione delle esperienze tra laboratori e la creazione di appositi database.
BIBLIOGRAFIA
1. EFSA, 2010. The Community Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and food-borne outbreaks in the European Union in 2008. pp. 1496.
2. Lindstedt,B.A., Tham,W., nielsson-Tham,M.L., Vardund,T., Helmersson,S. and Kapperud,G. (2008). Multiple-locus variable-number tandem-repeats analysis of Listeria monocytogenes using multicolour capillary electrophoresis and comparison with pulsed-field gel electrophoresis typing. J. Microbiol Methods, 72, 141-148.
3. Orsi,R.H., Bakker,H.C. and Wiedmann,M., 2010. Listeria monocytogenes lineages: Genomics, evolution, ecology, and phenotypic characteristics. Int. J. Med. Microbiol.
4. Parisi,A., Latorre,L., Normanno,G., Miccolupo,A., Fraccalvieri,R., Lorusso,V. and Santagada,G. (2010). Amplified Fragment Length Polymorphism and Multi-Locus Sequence Typing for high-resolution genotyping of Listeria monocytogenes from foods and the environment. Food Microbiol, 27, 101-108.
5. Schonberg,A., Bannerman,E., Courtieu,A.L., Kiss,R., McLauchlin,J., Shah,S. and Wilhelms,D., 1996. Serotyping of 80 strains from the WHO multicentre international typing study of Listeria monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 32, 279-287.
6. Sperry,K.E., Kathariou,S., Edwards,J.S. and Wolf,L.A. (2008). Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis as a tool for subtyping Listeria monocytogenes strains. J. Clin Microbiol, 46, 1435-1450.
RINGRAZIAMENTI: Si ringraziano per la collaborazione tecnica Bulzacchelli A. e Giannico A..
Questo lavoro è stato supportato dal finanziamento del Ministero della Salute (Ricerca corrente IZSPB002/07)
Fig. 1: MLVA isolati di Listeria monocytogenes di origine alimentare ed umana. Valutazione mediante Minimum Spanning Tree: la dimensione degli circoli è funzione del numero di isolati mentre il colore codifica per l’origine degli stessi.
APPLICAZIONE DELLA TECNICA MLVA NELLE STRATEGIE DI ERADICAZIONE DELLA BRUCELLOSI
Borriello G., Cozza D., Loporchio R., Valvini O., Guarino A., Galiero G.Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno, Dipartimento di Sanità Animale, Portici (NA)
Key words: Brucella, MLVA
SUMMARY
Sixty-three isolates of Brucella spp. from cattle and water buffalo were characterized by standard methods and by MLVA analysis. The biochemical/molecular technique identified B. abortus bv 1 (60%), bv 3 (38%) and B. melitensis bv 3 (2%). MLVA analysis displayed 51 different genotypes. These data confirm the high discriminating potential of MLVA and indicate that brucellosis is still a serious problem in water buffalo and bovine herds in the Campania region, characterized by multiplicity of infection sources associated with environmental persistence of the bacterium.
INTRODUZIONE
Brucella spp. è un patogeno estremamente diffuso nell’area Mediterranea, e in particolare nell’Italia meridionale. L’infezione causata da questo microrganismo è causa di ingenti perdite economiche negli allevamenti, e, oltretutto, può essere trasmessa all’uomo attraverso il consumo di latte o prodotti lattiero-caseari contaminati, oppure attraverso il contatto diretto/ indiretto con animali infetti. Le specie animali da allevamento maggiormente interessate sono quella bufalina, quella bovina e quella ovicaprina.
Il genere Brucella è altamente omogeneo, con un livello di omologia del DNA superiore al 90%, e la classificazione dei ceppi microbici nell’ambito di questo genere si basa principalmente su differenze di patogenicità, preferenze di ospite, e test microbiologici convenzionali usati per la fenotipizzazione (biotyping) (2).
Recentemente, l’analisi MLVA (multiple-locus variable-number tandem repeat analysis) si è dimostrata altamente discriminante per la caratterizzazione genetica di isolati appartenenti a specie batteriche monomorfiche quali Yersinia pestis, Mycobacterium bovis, Salmonella enterica e Brucella spp. (3, 4, 5, 7).
Lo scopo del presente lavoro è stato di caratterizzare mediante analisi MLVA ceppi di Brucella spp. di origine bovina e bufalina, isolati in diversi allevamenti della regione Campania, al fine di approfondire gli aspetti epidemiologici e di diffusione della malattia nel territorio.
MATERIALI E METODI
Ceppi batterici
Il presente studio è stato condotto su ceppi di Brucella spp. isolati da bovini e bufali risultati positivi alle prove sierologiche nell’ambito del piano di risanamento nazionale per la brucellosi della regione Campania, nel periodo 2008-2010. Sono stati in tal modo raccolti 63 ceppi di Brucella provenienti da 18 allevamenti bovini e 25 allevamenti bufalini. I ceppi sono stati isolati mediante metodo microbiologico (6). Le colonie morfologicamente simili a Brucella sono state identificate mediante prove biochimiche e sierologiche e successivamente tipizzate mediante PCR dal Centro di Referenza Nazionale per le Brucellosi, ubicato presso l’Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Teramo.
Estrazione del DNA batterico e caratterizzazione MLVA Il DNA dei ceppi di Brucella è stato estratto mediante bollitura.
Brevemente, le colonie sono state sospese in 100 ml di acqua distillata sterile e bollite per 10 min. Dopo centrifugazione a 10.000 rpm per 5 min, il supernatante è stato prelevato ed utilizzato per le analisi successive.
L’amplificazione del DNA batterico è stata effettuata mediante PCR in un volume finale di 25 ml utilizzando la Master Mix della Qiagen. A tale scopo sono state utilizzate sedici coppie di primers suddivise in tre gruppi (1, 3): il panel 1 (loci Bruce06, Bruce 08, Bruce11, Bruce12, Bruce42, Bruce43, Bruce45 e Bruce55), panel 2A (loci Bruce18, Bruce19 e Bruce21) e panel 2B (loci Bruce04, Bruce07, Bruce09, Bruce16 e Bruce 30). I prodotti di PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi capillare.
RISULTATI E DISCUSSIONE
Durante il periodo dello studio, dal 2008 al 2010, sono stati raccolti 63 isolati di Brucella da linfonodi di animali, bovini e bufali, abbattuti nell’ambito del piano di risanamento della brucellosi nella regione Campania. La caratterizzazione ha identificato 38 ceppi di B. abortus biovar 1 (60%), 24 ceppi di B. abortus biovar 3 (38%) e 1 ceppo di B. melitensis biovar 3 (2%).
La distribuzione dei diversi biotipi nell’ambito delle specie animali in esame mostra che il biotipo B. abortus biovar 1 è risultato più frequente nella specie bufalina (89%); il biotipo B. abortus biovar 3 è risultato equamente presente in entrambe le specie (54% e 46% in bovini e bufali, rispettivamente), mentre l’unico ceppo di B. melitensis biovar 3 è stato isolato da un bovino (Fig. 1).
Fig. 1 – Frequenza dei biotipi di Brucella isolati da bovini e bufali della regione Campania
Tutti gli isolati di Brucella sono stati poi tipizzati mediante tecnica MLVA-16. I risultati della caratterizzazione molecolare mostrano l’esistenza di 51 diversi genotipi, confermando il grande potere discriminate di questa tecnica. Infatti, nell’ambito di ognuna delle singole specie di Brucella identificate, sono stati individuati numerosi genotipi MLVA diversi (Tabella 1), con un potere discriminate del 74% nel caso di B. abortus biovar 1 e del 92% nel caso di B. abortus biovar 3.
isolato un unico ceppo di Brucella, mentre in 11 casi sono stati effettuati degli isolamenti multipli. È interessante notare che in 9 casi sono stati isolati genotipi identici di Brucella da allevamenti diversi, spesso molto vicini geograficamente o addirittura confinanti.
Tab. 1 – Corrispondenza tra specie di Brucella spp. individuate mediante metodo biochimico/molecolare e genotipi diversi individuati mediante tecnica MLVA
Specie n. isolati n. genotipi diversi
B. abortus 1 38 28
B. abortus 3 24 22
B. melitensis 3 1 1
Questo risultato suggerisce che queste aziende sono probabilmente carenti nell’applicazione delle misure di biosicurezza, ovvero sono carenti per quel che concerne i requisiti logistici, strutturali, gestionali e del personale necessari per impedire l’ingresso e la circolazione di patogeni all’interno dell’allevamento. Tra le 11 aziende dove invece è stato isolato più di un ceppo di Brucella, si possono osservare tre diverse tipologie di contesti. In 3 aziende sono stati isolati ceppi aventi lo stesso genotipo, o comunque genotipi estremamente simili. Le modifiche nei genotipi osservati sono causate dalla capacità intrinseca di qualunque batterio, Brucella inclusa, di generare mutanti nei loci codificanti ripetizioni a tandem, con una velocità di mutazione variabile. I loci inclusi nello schema MLVA utilizzato presentano infatti diverse frequenze di mutazione, e possono pertanto essere suddivisi in due grandi gruppi: il pannello 1, meno variabile, e dunque indicativo della provenienza geografica (intesa per grandi aree) del ceppo in esame; il pannello 2, invece, molto variabile, più indicativo della effettiva distanza genetica tra due o più ceppi. Tali mutazioni sono principalmente legate ai processi di replicazione in vivo, di dispersione nell’ambiente attraverso i prodotti dell’aborto, di resistenza ai fattori esterni e di re-infezione degli animali. La presenza costante nel tempo in un’azienda di ceppi geneticamente identici o solo lievemente differenti, ovvero variabili solo nei loci del pannello 2, è indicativa di una carenza dei requisiti di biocontenimento, ovvero di tutte le misure atte a limitare la diffusione dei patogeni presenti nell’allevamento al fine di impedire il contagio degli animali. In 6 aziende, invece, è stata osservata la presenza di ceppi di Brucella diversi tra loro, con differenze marcate, ovvero relative ad entrambi i pannelli analizzati. Questa condizione, soprattutto nei casi in cui questi isolamenti sono avvenuti in un arco temporale ristretto (c.ca un anno), sono indicativi di una molteplicità di fonti di infezione, ancora una volta ascrivibile ad una carenza dei requisiti di biosicurezza. In 2 aziende, infine, durante tutto il periodo di studio, sono stati isolati numerosi ceppi di Brucella, caratterizzati sia da genotipi uguali o molto simili, sia da genotipi estremamente diversi tra loro. In questo caso le aziende coinvolte sono probabilmente caratterizzate da requisiti logistico/strutturali/gestionali insufficienti a garantire la biosicurezza e il biocontenimento.
I risultati della nostra indagine, dunque, ritraggono un quadro epidemiologico ancora critico in merito alle misure di biosicurezza messe in atto per contrastare la diffusione della
brucellosi. Infatti, in primo luogo, la presenza di ceppi molto diversi in alcuni allevamenti, lascia supporre che in questi gli episodi di brucellosi sono generati da ceppi originatisi da diverse fonti di infezione. In altre aziende, la presenza di ceppi poco distanti geneticamente tra loro, può essere indicativa di infezioni reiterate nel tempo e causate da un unico ceppo che persiste nell’allevamento. La persistenza del batterio può essere causata sia da inidonee o inefficaci misure di disinfezione e di movimentazione/stabulazione degli animali, sia dall’eventuale presenza di reservoir naturali di Brucella spp. nell’allevamento, ovvero di animali sierologicamente negativi in grado, però, di eliminare il batterio nell’ambiente.
Gli studi sulla diversità genetica degli isolati di Brucella forniscono validi strumenti epidemiologici che si possono utilizzare per una più efficace azione di contrasto finalizzata all’eradicazione della malattia. Nonostante la parzialità del dato raccolto, in riferimento al numero limitato di allevamenti in studio, i risultati sono comunque significativi per gli scenari che dal punto di vista epidemiologico sono in grado di offrire.
RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI
1) Al Dahouk S, PL Flèche, K Nöckler, I Jacques, M Grayon, HC Scholz, H Tomaso, G Vergnaud, H Neubauer (2007) - «Evaluation of Brucella MLVA typing for human brucellosis». J Microbiol Methods. 69: 137-145.
2) Alton GG, Jones LM, Angus RD, Verger JM (1988) - «Techniques for the brucellosis laboratory». Paris, France, INRA.
3) Le Flèche P, Jacques I, Grayon M, Al Dahouk S, Bouchon P, Denoeud F, Nöckler K, Neubauer H, Guilloteau LA, Vergnaud G (2006) - «Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay». BMC Microbiol. 9: 6-9.
4) Lowell JL, Wagner DM, Atshabar B, Antolin MF, Vogler AJ, Keim P, Chu MC, Gage KL (2005) - «Identifying sources of human exposure to plague». J Clin Microbiol. 43: 650-656. 5) Martinez LR, Harris B, Black WC4th, Meyer RM, Brennan PJ, Vissa VD, Jones RL (2008) «Genotyping North American animal Mycobacterium bovis isolates using multilocus variable number tandem repeat analysis». J Vet Diagn Invest. 20: 707- 715.
6) OIE Manual: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2009 (Cap. 2.4.3, versione adottata a maggio 2009).
7) Ramisse V, Houssu P, Hernandez E, Denoeud F, Hilaire V, Lisanti O, Ramisse F, Cavallo JD, Vergnaud G (2004) - «Variable number of tandem repeats in Salmonella enterica subsp. enterica for typing purposes». J Clin Microbiol. 42: 5722-5730.