Barco L.1, Ramon E.1, Dalla Pozza M. C.1, Longo A.1, Lettini A.1, Minorello C.1, Saccardin C.1, Dionisi Am.2, Ricci A.1
1Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Centro di Referenza Nazionale per le Salmonellosi, Legnaro (PD) 2Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Malattie Infettive, parassitarie e immunomediate, Roma
Keywords: Salmonella 4,[5],12:i:-, PFGE
INTRODUZIONE
Salmonella enterica 4,[5],12:i:- viene considerata come variante monofasica di S. Typhimurium e rappresenta un sierotipo emergente per i numerosi episodi di tossinfezione ad esso associati. Dal punto di vista fenotipico il profilo di antibiotico resistenza più diffuso per questo sierotipo è rappresentato da Ampicillina, Streptomicina, Sulfonamidi e Tetraciclina (ASSuT) (1). Per quanto concerne invece la fagotipizzazione, eseguita impiegando lo schema specifico per S. Typhimurium, sono stati descritti differenti fagotipi tra i quali, negli ultimi anni, si è verificato un incremento degli isolati appartenenti al fagotipo DT193 (2). L’interesse verso ceppi con queste caratteristiche si è ulteriormente acuito quando nel 2006 è stato descritto in Lussemburgo un focolaio di salmonellosi causato da S. 4,[5],12:i- che ha determinato la morte di una persona ed è stato associato al consumo di carne suina. Nello specifico, il ceppo responsabile di questo episodio è stato descritto come DT193, tetraresistente (ASSuT) con profilo di PFGE STYMXB.0131 (3). Indagini successive hanno permesso di ipotizzare che tale linea clonale si stia progressivamente diffondendo in Europa (4). L’obiettivo del presente studio è: 1) descrivere ceppi con caratteristiche analoghe, isolati in Italia, associati a due distinti episodi di salmonellosi nell’uomo e 2) descrivere l’approccio molecolare utilizzato per caratterizzare e distinguere gli isolati riconducibili ai due episodi.
MATERIALI E METODI
I 27 ceppi di Salmonella 4,[5],12:i- studiati sono stati isolati nell’ambito di due episodi di salmonellosi, verificatisi rispettivamente nel 2009 e nel 2010 in due differenti regioni del Nord Italia. Nell’ambito dell’episodio A, S. 4,[5],12:i- DT193 ASSuT è stata isolata da un gatto e da due proprietari dell’animale (un adulto e un bambino). L’episodio B invece ha interessato un esercizio di ristorazione collettiva, presso il quale venivano allevati polli e suini destinati alla produzione di parte degli alimenti somministrati nell’esercizio stesso. In questo caso, S. 4,[5],12:i- DT193 ASSuT è stata isolata dai polli e suini allevati nella struttura, da differenti tipologie di salumi e insaccati, freschi e stagionati, ottenuti con le carni dei suini allevati presso la struttura, e dai clienti del ristorante che hanno manifestato salmonellosi. L’isolamento di Salmonella è stato eseguito utilizzando la ISO 6579:2002 –Cor1:2004 e l’ AnnexD/ ISO 6579:2007. Gli isolati di Salmonella sono stati sierotipizzati secondo lo schema di Kauffman-White tramite agglutinazione a vetrino, quindi la conferma dell’assenza del gene fljB, caratteristica degli ceppi di Salmonella monofasici, è stata realizzata attraverso un saggio in PCR (5) La tipizzazione fagica è stata eseguita seguendo lo schema interpretativo dell’International Federation for Enteric Phage Typing (HPA, Colindale, London). Quindi, è stato determinato il profilo di antibiotico-resistenza secondo il metodo Kirby -Bauer testando le seguenti molecole: colistina, sulfametoxazolo + trimetoprim, kanamicina, gentamicina, ceftazidime, cefotaxime, amoxicillina + acido clavulanico, acido nalidixico, tetraciclina, ampicillina, streptomicina, sulfonamidi,
cloramfenicolo, cefalotina, enrofloxacin e ciprofloxacin. I ceppi sono stati subtipizzati attraverso Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) impiegando tre differenti enzimi di restrizione (XbaI, SpeI e BlnI) in accordo con il protocollo PulseNet. L’analisi dei cluster è stata eseguita utilizzando il software InfoQuest FP v. 4.5 (Bio-Rad, Hercules, CA). Quindi, il coefficiente di Dice è stato utilizzato per calcolare i valori di similarità e l’algoritmo UPMGA (unweighted pair group method with arithmetic means), con 2.00% di tolleranza e 1.00% di ottimizzazione, per ottenere il dendrogramma. I profili di PFGE che differivano per almeno una banda sono stati considerati come distinti. Infine, i profili ottenuti utilizzando XbaI sono stati confrontati con quelli del database internazionale gestito dalla Health Protection Agency (HPA) in modo tale da riuscire ad attribuire il nome del pulsotipo in accordo con la nomenclatura definita dal sistema PulseNet Europa. RISULTATI
Tutti gli isolati ottenuti nell’ambito dei due episodi (27) sono stati confermati come S. 4,[5],12:i:-, appartenenti al fagotipo DT193 e con profilo di resistenza ASSuT. La PFGE, eseguita con enzima XbaI, ha permesso di classificare gli isolati in due differenti pulsotipi: STYMXB.0131, che rappresentava quello dominante, e un secondo pulsotipo, classificato come STYMXB.0131a, dal momento che non corrispondeva a nessun profilo codificato dal sistema Pulsenet, e che differiva dal precedente per una sola banda. A quest’ultimo pulsotipo appartenevano 4 ceppi isolati nell’ambito dell’episodio B, rispettivamente da 3 campioni di feci suine e 1 campione di salume. Al pulsotipo STYMXB.0131 invece appartenevano i 4 ceppi isolati nell’ambito dell’episodio A e i rimanenti 19 ceppi isolati nell’ambito dell’episodio B (1 ceppo da feci di pollo, 7 da feci di suino, 7 da insaccati e salumi, 4 da clienti del ristorante). In definitiva, 23 ceppi isolati dai due episodi di salmonellosi, non correlati epidemiologicamente, risultavano indistinguibili dal punto di vista fenotipico e genotipico. Si è quindi proseguita l’analisi di subtipizzazione molecolare dei 23 ceppi appartenenti al pulsotipo STYMXB.0131 con PFGE impiegando gli enzimi di restrizione SpeI e BlnI per discriminare gli isolati riconducibili ai due episodi. Utilizzando l’enzima SpeI tutti i ceppi testati si sono riconfermati indistinguibili. L’analisi eseguita con BlnI invece ha permesso di differenziare gli isolati riconducibili ai due episodi (Fig.1). Con tale enzima complessivamente sono stati ottenuti 3 differenti profili. Il profilo 1 comprendeva 3 ceppi riconducibili all’episodio B (1 ceppo isolato da feci di pollo, 1 ceppo isolato da salume e 1 ceppo umano), al profilo 2 appartenevano 16 ceppi tutti riconducibili all’episodio B (7 ceppi isolati da feci suine, 6 ceppi isolati da salumi e insaccati e 3 ceppi umani), mentre al profilo 3 appartenevano i 4 ceppi isolati nell’ambito dell’episodio A. Il coefficiente di similarità tra i profili 1 e 2 è risultato pari a 96%, mentre tra i primi due profili e il terzo il coefficiente è risultato pari a 91%.
DISCUSSIONE
Salmonella 4,[5],12:i:- viene descritta come un sierotipo emergente con diffusione su scala mondiale. Studi recenti
hanno dimostrato che tale sierotipo rappresenta un rischio per la salute pubblica, del tutto paragonabile a S. Typhimurium e direttamente correlato al consumo di alimenti a base di carne suina (4). Tra i cloni emergenti descritti per questo sierotipo vi è il DT193, ASSuT, STYMXB.0131, che è stato collegato prevalentemente alla filiera suina (1,4). I due episodi di salmonellosi descritti nel presente lavoro dimostrano che anche nel nostro Paese si sono rapidamente diffusi ceppi che presentano queste caratteristiche fenotipiche e genotipiche e sono caratterizzati da rilevante patogenicità. Questa indagine ha permesso di confermare che, a differenza di quanto descritto fino a questo momento, tale clone non sia specifico della filiera suina e che la trasmissione all’uomo non avvenga esclusivamente attraverso il consumo di alimenti contaminati, ma, al contrario, sembra interessare anche animali d’affezione e la trasmissione all’uomo si può verificare anche per contatto diretto con gli animali infetti. La PFGE viene riconosciuta come “gold standard” per la subtipizzazione di differenti batteri patogeni tra cui salmonella. Tuttavia è stato dimostrato che, per alcuni sierotipi molto clonali (come S. Enteritidis), la PFGE eseguita utilizzando un singolo enzima di restrizione presenta un potere discriminante molto limitato. Lo studio condotto ha permesso di evidenziare che sebbene S. 4,[5],12:i:- sia stato descritto come un sierotipo piuttosto eterogeneo, sembra presentare ceppi particolarmente clonali, caratterizzati da ampia diffusibilità. Sulla base dei risultati qui presentati, la PFGE condotta esclusivamente con XbaI non ha permesso di differenziare ceppi epidemiologicamente distinti. L’impiego combinato di XbaI e BlnI invece ha determinato un aumento del potere discriminate della metodica, tale da permettere la differenziazione dei ceppi isolati nell’ambito dei due episodi. Infatti i dati riportati dimostrano che, nell’ambito di studi epidemiologici mirati alla valutazione della correlazione tra ceppi, è auspicabile non limitare l’analisi di PFGE ad un singolo enzima di restrizione, ma aumentare il potere discriminante della metodica impiegando un secondo enzima.
SUMMARY
Salmonella 1,4,[5],12:i:- is a monophasic variant of S. Typhimurium, and is considered an emerging epidemic serovar. A clonal lineage of this serovar (characterized by phage-type: DT193, antimicrobial resistance profile: ASSuT, PFGE profile: STYMXB.0131) is currently spreading within Europe and was responsible of a very severe outbreak in Luxemburg in 2006. The aims of the present paper were: 1) to describe strains of this clonal lineage isolated in Italy during two distinct Salmonella outbreaks and, 2) to present the molecular approach used to characterize and distinguish strains attributable to the two outbreaks.
BIBLIOGRAFIA
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Figura 1 Dendrogramma relativo alla selezione di ceppi S. 4,[5],12:i:- DT193 ASSuT STYMXB.0131 isolati nell’ambito dei due episodi di salmonellosi, generato dall’analisi PFGE eseguita con BlnI