Cremonesi P.1 & Chessa S.1, Ricchi M.2, Pozzi F. 3, Castiglioni B.1, Luini M.3
1IBBA – CNR, Lodi; 2IZSLER - Sezione di Piacenza; 3IZSLER - Sezione di Lodi
Key Words: Prototheca spp., mastite, SSCP
INTRODUZIONE
Dopo la prima descrizione (1) di mastite bovina causata dall’alga unicellulare Prototheca zopfii e successive sporadiche segnalazioni, recentemente si è assistito in varie parti del mondo ad un incremento dell’incidenza di mastite bovina causata da quest’alga (6, 8). Le mastiti dovute a Prototheca zopfii sono un grave problema per l’allevamento poiché tali infezioni raramente sono associate a segni clinici evidenti ma determinano un rialzo delle cellule somatiche del latte e presentano una limitata o del tutto assente risposta alla maggior parte dei trattamenti sanitari (7). Le specie patogene, sino ad ora riconosciute, sono quattro: Prototheca zopfii genotipo 2, Prototheca blaschkeae, Prototheca cutis e Prototheca wickerhamii. Le altre specie (Prototheca ulmea e Prototheca stagnora), così come il genotipo 1 di Prototheca zopfii sono considerate saprofite ambientali (7, 9, 10). Gli studi condotti sino ad ora mostrano una netta prevalenza di Prototheca zopfii genotipo 2 nell’eziologia della mastite bovina, mentre Prototheca blaschkeae è stata isolata solo sporadicamente (4, 7).
La tecnica PCR-SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism), utilizzata finora con successo per l’analisi di diversi geni nell’uomo e in molte specie animali e batteriche (5), permette di evidenziare fino all’80% delle mutazioni puntiformi del tratto di DNA in esame. Le mutazioni dovute a sostituzione nucleotidica provocano un polimorfismo della conformazione che il singolo filamento di DNA assume quando la doppia elica è sottoposta a denaturazione e che è determinato da un differente appaiamento intramolecolare delle basi. A questa diversa conformazione coincide una differente velocità di migrazione durante corsa elettroforetica in un gel di poliacrilammide verticale.
Il presente lavoro descrive l’uso della tecnica PCR-SSCP per distinguere Prototheca zopfii genotipo 1, Prototheca zopfii genotipo 2 e Prototheca blaschkeae in ceppi isolati da campioni di latte mastitico.
MATERIALI E METODI
Campioni - L’approccio metodologico è stato ottimizzato utilizzando sia ceppi di collezione di Prototheca spp. (Prototheca zopfii genotipo 1, IZSLER 308527; Prototheca zopfii genotipo 2, IZSLER 219509; Prototheca blaschkeae, IZSLER 161681) sia 15 ceppi di Prototheca spp. isolati da 9 campioni di latte di massa e da 6 campioni di latte mastitico di singola bovina provenienti da diversi allevamenti della provincia di Lodi. Gli isolati e i ceppi di collezione sono stati fatti crescere su piastre Sabouraud agar e in BHI agar mediante incubazione a 37°C per 48 ore.
Estrazione – Le cellule di Prototheca spp. sono state risospese in 50 µl di acqua distillata e, dopo sonicazione, il DNA è stato estratto dalle cellule dell’alga utilizzando il Kit PowerPlant® DNA Isolation (Mo Bio Laboratories, Inc.) seguendo il protocollo descritto dal fornitore. Contemporaneamente, dopo opportune modifiche, è stata utilizzata una procedura precedentemente
descritta in letteratura (2) ed ottimizzata per l’estrazione del DNA batterico direttamente da campioni di latte. Il protocollo modificato è stato testato sia sugli isolati sia direttamente sui campioni di latte mastitico. Il DNA ottenuto è stato quali- quantitativamente analizzato mediante Nanodrop®.
PCR - I primer utilizzati in questo studio sono stati disegnati in due regioni del gene 18S rRNA mediante il programma Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) ottenendo due amplificati di ampiezza pari a 313 bp e 290 bp. Il ciclo di amplificazione prevedeva una denaturazione iniziale a 94°C per 5 minuti seguita da 30 cicli di 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 56°C e 1 minuto a 72°C, con un’estensione finale a 72°C per 7 minuti. Le reazioni di amplificazione venivano condotte in un volume finale di 25 µl contenente ~ 30 ng di DNA, 12,5 µl di 2X PCR Master Mix (Fermentas, M-Medical) e 0,8 µM dei primer forward e reverse.
PCR-SSCP
L’analisi dei frammenti amplificati è stata effettuata mediante l’impiego della tecnica SSCP utilizzando un gel al 10% di concentrazione, con rapporto acrilammide:bisacrilammide di 37,5:1 in 0,5X Tris-borate EDTA (TBE). La corsa è stata fatta a 220 V e a temperatura di 9°C, per 15 ore.
Al termine della corsa elettroforetica i diversi pattern di migrazione sono stati rilevati dopo colorazione con nitrato d’argento, scelta in virtù della sua sensibilità.
RISULTATI
Estrazione - Dal confronto dei risultati ottenuti tra il KIT PowerPlant® DNA Isolation e il protocollo di estrazione da latte opportunamente modificato, è emersa una maggior resa nell’estrazione del DNA di Prototheca spp. mediante quest’ultimo (60 ± 15 ng/µl per il protocollo modificato rispetto a 25 ± 10 ng/µl per il KIT PowerPlant® DNA Isolation). I valori di assorbanza (D260/280) relativi alla qualità del materiale estratto hanno mostrato, per entrambe le procedure utilizzate, valori compresi tra 1,55 e 1,77.
PCR-SSCP – L’analisi simultanea di due regioni del gene 18S rRNA di 313 e 290 bp mediante PCR-SSCP ha permesso di identificare tre diversi pattern di migrazione. Il primo, a maggiore mobilità elettroforetica, è dato dalla Prototheca zopfii genotipo 1; il secondo, a mobilità elettroforetica intermedia, è dato dalla Prototheca zopfii genotipo 2; infine il terzo, a minore mobilità elettroforetica, è dato da Prototheca blaschkeae (Figura 1). Tutti i campioni isolati da latte di massa o da latte mastitico di singola bovina provenienti da diversi allevamenti della provincia di Lodi hanno dato lo stesso pattern di migrazione, corrispondente al pattern di migrazione intermedio, ovvero quello dato da Prototheca zopfii genotipo 2. Tre di questi campioni sono stati anche sottoposti a sequenziamento nucleotidico per verificare che corrispondessero effettivamente alla Prototheca zopfii genotipo 2.
L’analisi degli elettroferogrammi e il confronto con le sequenze depositate in banca dati hanno attestato la corrispondenza fra il pattern osservato e la Prototheca zopfii genotipo 2 confermando il risultato ottenuto con la tecnica PCR-SSCP. Figura 1: Analisi simultanea di due regioni del gene 18S rRNA di 313 e 290 bp mediante PCR-SSCP. 1=Prototheca zopfii genotipo 1; 2=Prototheca zopfii genotipo 2; 3=Prototheca blaschkeae; 4-6=ceppi di Prototheca spp. isolati da latte di massa provenienti da allevamenti con mastiti contagiose.
DISCUSSIONE
Hayashi (1991) ha stimato la sensibilità della metodica PCR-SSCP come probabilità di individuare una mutazione puntiforme, trovando valori del 99% per frammenti da 100 a 300 bp e dell’89% per frammenti da 300 a 450 bp. Per questo motivo basandosi sulle sequenze disponibili in banca dati si è scelto di disegnare due coppie di primer che amplificassero due frammenti di dimensioni ridotte che includessero regioni contenenti i polimorfismi noti nelle tre specie.
La PCR-SSCP è un metodo riproducibile, veloce e molto semplice per la rilevazione di SNP (Single Nucleotide Polymophism), delezioni/inserzioni e riarrangiamenti del DNA amplificato. Questo metodo è stato utilizzato con successo per l’analisi di diversi geni nell’uomo, in specie animali e batteriche (5), ma la tecnica non è mai stata utilizzata fino ad ora per l’analisi di queste alghe unicellulari. I ben distinti pattern di migrazione ottenuti dimostrano che le differenze osservate a livello genico sono sufficienti a discriminare efficacemente le tre specie.
L’approccio molecolare impiegato si è dimostrato, anche in questo caso, una tecnica di grande utilità per analizzare in modo rapido ed economico una variabilità genetica di queste specie.
L’analisi di campioni di campo conferma gli studi condotti in precedenza, che mostrano chiaramente la prevalenza di Prototheca zopfii genotipo 2 nell’eziologia della mastite bovina. Un ampliamento della campionatura è necessario per confermare tale risultato.
Requisito fondamentale per lo studio a livello molecolare della variabilità genetica è l’ottenimento di un DNA con buone caratteristiche in termini di quantità e qualità. In quest’ottica
si è inserito il confronto di diversi metodi di estrazione del DNA. Il protocollo modificato utilizzato in questo studio ha consentito di ottenere un DNA qualitativamente confrontabile ma quantitativamente superiore ai kit commerciali; inoltre tale protocollo è applicabile direttamente al campione di latte e non richiede pre-trattamento del campione né isolamento in coltura delle alghe.
ABSTRACT
We report the development of PCR-SSCP (PCR-Single Strand Conformational Polymorphism) to identify Prototheca spp., responsible for bovine mastitis: Prototheca zopfii (both genotypes) and Prototheca blaschkeae. The method was developed using reference strains belonging to Prototheca zopfii genotype 1, Prototheca zopfii genotype 2 and Prototheca blaschkeae. The assay was applied on 15 isolates of Prototheca spp. isolated from bovine mastitic milk or bulk tank milk samples, all identified as Prototheca zopfii genotype 2. We conclude that the described PCR-SSCP approach is accurate, inexpensive and highly suitable for the identification of Prototheca zopfii genotype 2 on field isolates but also directly on milk, if preceded by a specific DNA extraction method. BIBLIOGRAFIA
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